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Regulation of gene expression by chemical splicing directed by reversible formation of omega-shaped structure on DNA/RNA

Research Project

Project/Area Number 19K22259
Research Category

Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)

Allocation TypeMulti-year Fund
Review Section Medium-sized Section 37:Biomolecular chemistry and related fields
Research InstitutionKumamoto University

Principal Investigator

井原 敏博  熊本大学, 大学院先端科学研究部(工), 教授 (40253489)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 勝田 陽介  熊本大学, 大学院先端科学研究部(工), 助教 (50632460)
北村 裕介  熊本大学, 大学院先端科学研究部(工), 助教 (80433019)
Project Period (FY) 2019-06-28 – 2022-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2020)
Budget Amount *help
¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000)
Fiscal Year 2021: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
Fiscal Year 2019: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
Keywordsオメガ構造 / 遺伝子発現制御 / mRNA / 光制御 / G4構造誘導 / ステープル核酸 / 核酸医薬 / オメガ型構造 / 人工的スプライシング / 刺激応答 / 光応答性 / 金属イオン / G4構造 / 可逆的スプライシング / アントラセン / 錯生成 / グローバル構造
Outline of Research at the Start

化学合成DNA、内在性RNAの構造を操ってその塩基配列を可逆的に編集する。DNAやRNAの配列の一部をつまみ出し、一次構造においては互いに離れた二箇所を直接繋ぎ留めてΩ型の構造を形成することで一部の配列を バイパスした状態をつくる。DNAにおいては、その骨格上の特定の2箇所に刺激応答部位を挿入し、光や金属イオンなどの外部刺激によるΩ構造形成により標的とするmRNA等に相補的な新しい塩基配列を与えるような分子設計をする。RNAにおいては、トランスフェクションした修飾DNA、内在性、あるいは細胞内で過剰発現させた短いRNA等を用いて、mRNAの狙った箇所にΩ構造を誘起して翻訳等をブロックする。

Outline of Annual Research Achievements

DNAやRNAのグローバルな構造を操ってその塩基配列を可逆的にスプライシング(編集)する。具体的には標的とする生理活性分子、及び 内在性、または細胞導入した短いDNAやmiRNA等を鋳型にして a)修飾DNAや b)mRNAの配列の一部をつまみ出し、一次構造においては互いに離れた二箇所を繋ぎ留めてΩ型構造を形成させる。a)化学修飾DNAにおいては、光や金属イオンなどの刺激によりΩ構造を固定化し、特定のmRNAに相補的な新しい塩基配列を与えるよう配列設計する。アンチセンスの作用機序を利用して当該遺伝子をノックダウンする。b)RNAは化学修飾せず、天然のmRNAにΩ構造を誘導し、当該遺伝子の発現を制御したい。
グアニンの連続配列は非常に安定なグアニン4重鎖(G4)構造を形成する。この配列を分断したスプリットG4配列にΩ構造を誘導しグアニン4重鎖(G4)構造を形成させることで当該遺伝子の発現制御が可能である。具体的には、短鎖核酸(ステープル核酸)を用いてmRNAの5'UTRにG4構造を誘起し、リボソームの進行を止めることで遺伝子を制御したい。in vitroの系においては様々な人工遺伝子について本原理の有効性を確認することができた。本原理には一般性があり、与えられた遺伝子に対してステープル核酸を設計することもできるし(遺伝子発現制御、すなわち核酸医薬の必要条件)、逆に特定のステープル核酸に対してスプリットG4配列を有するmRNAを設計する(核酸検出、特にmiRNAの高感度検出のための必要条件)ことも可能であった。さらに、天然の遺伝子に対しても、in vitro、およびin cellにおいて遺伝子発現を抑制できることを示すことができた。さらに、本学医学部との共同研究によりTRPC6を高発現している高血圧の病態マウスを使って遺伝子制御にも取り組んでおり期待した成果をあげつつある。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究で提案しているΩ型構造誘導を利用した遺伝子発現制御に関しては、動作原理の一般性を示すことができた。その有効性を、in vitro → in cell → in vivoの流れで着実に検証することに成功している。動物実験は、当研究室だけではすぐに実施することが難しい。別の研究において共同研究を実施していた本学医学部の研究者がTRPC6の病態マウスを扱っていたので、すぐに共同研究を開始することができた。

Strategy for Future Research Activity

本年度は以下の2つの項目に関して重点的に研究を進める。
動作原理に関する基礎研究:
ステープル核酸によりmRNAの5'UTRにΩ構造を形成させ、互いに離れていたグアニン連続配列を近づけ、G4構造を誘起する。遺伝子制御技術以前に、核酸科学、特に核酸構造の基礎研究の立場からこの現象はたいへん興味深い。介在配列(ループ)の長さとG4構造の熱安定性の関係、G4構造形成後にステープル核酸が解離してもG4構造は維持されるのか、もし維持されるなら少量のステープル核酸をターンオーバーして多くのG4構造を触媒的に誘導することは可能なのか、などの興味深い課題に取り組みたい。
核酸医薬としての応用研究:
核酸医薬としての応用研究を本格的に推進するために、病態マウスに修飾核酸を投与してその効果を確認する。修飾核酸としては浅沼氏(名大工)の開発したL-aTNA、SNAや、小比賀氏(阪大薬)の開発したBNAを使用する予定である。L-aTNAに関しては、既に必要な塩基配列の幾つかのステープルL-aTNAを提供していただき、TRPC6の高発現マウスに対して投与しその活性の確認を行う予定で準備を進めている。また、神経性疾患の治療に関して、東京医科歯科大学の横田氏との共同研究も正式にスタートした。

Report

(2 results)
  • 2020 Research-status Report
  • 2019 Research-status Report

Research Products

(21 results)

All 2020 2019

All Journal Article (10 results) (of which Peer Reviewed: 10 results) Presentation (10 results) (of which Int'l Joint Research: 3 results,  Invited: 4 results) Book (1 results)

  • [Journal Article] Cooperative recognition of a repetitive sequence through consecutive formation of triplex and duplex structures2020

    • Author(s)
      Kitamura Yusuke、Nagai Koki、Furuzono Tomohiro、Katsuda Yousuke、Ihara Toshihiro
    • Journal Title

      Nucleos. Nucleot. Nucleic Acids

      Volume: 39 Pages: 97-108

    • DOI

      10.1080/15257770.2019.1679833

    • Related Report
      2020 Research-status Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Xylitol Separation from a Polyol Mixture Using Lanthanide Ion-loaded Resins2020

    • Author(s)
      Yusuke Kitamura, Rika Shobu, Hirotaka Matsuura, Akinori Jyo, Toshihiro Ihara
    • Journal Title

      Anal. Sci.

      Volume: 36 Issue: 6 Pages: 769-769

    • DOI

      10.2116/analsci.19n032

      10.2116/analsci.19N032

    • NAID

      130007853445

    • ISSN
      0910-6340, 1348-2246
    • Related Report
      2020 Research-status Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Catalytic formation of luminescent lanthanide complexes using an entropy-driven DNA circuit2020

    • Author(s)
      Yusuke Kitamura, Yukina Azuma, Yousuke Katsuda, Toshihiro Ihara
    • Journal Title

      Chem. Commun.

      Volume: 56 Pages: 3863-3863

    • DOI

      10.1039/d0cc00602e

    • Related Report
      2020 Research-status Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Electrochemical Molecular Beacon for Nucleic Acid Sensing in a Homogeneous Solution2020

    • Author(s)
      Yusuke KITAMURA, Kotaro MISHIO, Pelin ARSLAN, Boui IKEDA, Chiharu IMOTO, Yousuke KATSUDA, Toshihiro IHARA
    • Journal Title

      Anal. Sci.

      Volume: 36 Issue: 8 Pages: 959-959

    • DOI

      10.2116/analsci.19p456

      10.2116/analsci.19P456

    • NAID

      130007886432

    • ISSN
      0910-6340, 1348-2246
    • Related Report
      2020 Research-status Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] A RuO<sub>2</sub> Nanosheet as a Novel Quencher-free Platform for the Detection of Nucleic Acids in a Homogeneous Solution2020

    • Author(s)
      KITAMURA Yusuke、TANIGUCHI Takaaki、TSUTSUMI Miwako、NURDIWIJAYANTO Leanddas、MATSUO Tomoya、KATSUDA Yousuke、IHARA Toshihiro
    • Journal Title

      Anal. Sci.

      Volume: 36 Issue: 4 Pages: 397-397

    • DOI

      10.2116/analsci.20c004

      10.2116/analsci.20C004

    • NAID

      130007830180

    • ISSN
      0910-6340, 1348-2246
    • Related Report
      2020 Research-status Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Detection of prostate-specific antigen in semen using DNA aptamers: an application of nucleic acid aptamers in forensic body fluid identification2020

    • Author(s)
      Tetsuya Satoh, Seiya Kouroki, Yusuke Kitamura, Toshihiro Ihara, Kazutoshi Matsumura, Susumu Iwase
    • Journal Title

      Anal. Methods

      Volume: 12 Pages: 2703-2703

    • DOI

      10.1039/d0ay00371a

    • Related Report
      2020 Research-status Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] A dynamically deformable microfilter for selective separation of specific substances in microfluidics2020

    • Author(s)
      Seitaro Kumamoto, Kenshiro Nakatake, Souichiro Fukuyama, Keiichiro Yasuda, Yusuke Kitamura, Masaaki Iwatsuki, Hideo Baba, Toshihiro Ihara, Yoshitaka Nakanishi, Yuta Nakashima
    • Journal Title

      Biomicrofluidics

      Volume: 14 Pages: 064113-064113

    • DOI

      10.1063/5.0025927

    • Related Report
      2020 Research-status Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] G-quadruplexes in mRNA: A key structure for biological function2020

    • Author(s)
      Kamura Takuto、Katsuda Yousuke、Kitamura Yusuke、Ihara Toshihiro
    • Journal Title

      Biochem. Biophys. Res. Commun.

      Volume: 526 Pages: 261-261

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2020.02.168

    • Related Report
      2020 Research-status Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Catalytic Formation of Luminescent Complex Clusters Based on Autonomous Strand Exchange Reaction of DNA2019

    • Author(s)
      Y. Kitamura, A. Nozaki, R. Ozaki, Y. Katsuda, T. Ihara
    • Journal Title

      ACS Applied Bio Materials

      Volume: 2 Pages: 2988-2933

    • DOI

      10.1021/acsabm.9b00326

    • Related Report
      2019 Research-status Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] A novel cholinesterase assay for the evaluation of neurotoxin poisoning based on the electron-transfer promotion effect of thiocholine on an Au electrode2019

    • Author(s)
      Hiroshi Shimada, Yuki Kiyozumi, Yuki Koga, Yoko Ogata, Yousuke Katsuda, Yusuke Kitamura, Masaaki Iwatsuki, Katsuhiko Nishiyama, Hideo Baba, and Toshihiro Ihara
    • Journal Title

      Sensors and Actuators B: Chemical

      Volume: 298 Pages: 126893-126893

    • DOI

      10.1016/j.snb.2019.126893

    • Related Report
      2019 Research-status Report
    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 核酸化学に基づいて生命現象を診る・制御する2020

    • Author(s)
      井原敏博
    • Organizer
      2020年 日本化学会九州支部秋期研究発表会
    • Related Report
      2020 Research-status Report
    • Invited
  • [Presentation] 細胞内microRNAの高感度検出を目的とした新規リボスイッチの開発2020

    • Author(s)
      吉田 翔;勝田 陽介;北村 裕介;佐藤 慎一;井原 敏博
    • Organizer
      日本分析化学会第69年会
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      2020 Research-status Report
  • [Presentation] ルテニウム-白金複合錯体を鋳型特異的に放出するDNAプローブの合成とその遺伝子解析への応用2020

    • Author(s)
      小嶋 美鈴;北村 裕介;勝田 陽介;井原 敏博
    • Organizer
      日本分析化学会第69年会
    • Related Report
      2020 Research-status Report
  • [Presentation] 核酸の連鎖的鎖交換反応を利用したシグナル増幅型腫瘍細胞検出法の開発2020

    • Author(s)
      北村 裕介;工藤 悠暉;勝田 陽介;中島 雄太;安田 敬一郎;熊本 清太郎;岩槻 政晃;馬場 秀夫;中西 義孝;井原 敏博
    • Organizer
      日本分析化学会第69年会
    • Related Report
      2020 Research-status Report
  • [Presentation] アントラセン光二量化反応を利用した鎖乗り換え型三本鎖核酸の形成2020

    • Author(s)
      小嶋 美鈴;西村 健人;北村 裕介;勝田 陽介;井原 敏博
    • Organizer
      第14回バイオ関連化学シンポジウム2020
    • Related Report
      2020 Research-status Report
  • [Presentation] RNA 高次構造の分割と再構成による新規リボスイッチの設計2020

    • Author(s)
      吉田 翔;勝田 陽介;佐藤 慎一;北村 裕介;井原 敏博
    • Organizer
      第14回バイオ関連化学シンポジウム2020
    • Related Report
      2020 Research-status Report
  • [Presentation] Control of the global structures of DNA/RNA for regulation of gene expression2019

    • Author(s)
      T. Ihara
    • Organizer
      The 12th JKBT
    • Related Report
      2019 Research-status Report
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Development of a novel technology for suppression of gene expression based on specific secondary structure induction in RNA by staple oligomer2019

    • Author(s)
      Takuto Kamura, Yousuke Katsuda, Yusuke Kitamura, Masaki Hagihara, Shinichi Sato, Toshihiro Ihara
    • Organizer
      The 14th International Student Conference on Advanced Science and Technology
    • Related Report
      2019 Research-status Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 核酸の高次構造形成に基づく機能創出2019

    • Author(s)
      井原敏博
    • Organizer
      日本化学会第99春季年会
    • Related Report
      2019 Research-status Report
    • Invited
  • [Presentation] Regulation of DNAzyme Activity and Gene Expression by Structure Control of Relevant DNA/RNA2019

    • Author(s)
      T. Ihara, T. Kamura, H. Ohura, Y. Kitamura, S. Sato, M. Hagihara, Y. Katsuda
    • Organizer
      The 24th Joint Seminar of the Kyushu Branch of the CSJ and the Busan Branch of KCS
    • Related Report
      2019 Research-status Report
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Book] 核酸科学ハンドブック2020

    • Author(s)
      日本核酸化学会、共同執筆
    • Total Pages
      576
    • Publisher
      講談社
    • ISBN
      9784065207864
    • Related Report
      2020 Research-status Report

URL: 

Published: 2019-07-04   Modified: 2021-12-27  

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