Identification of tetrodotoxin in marine sediments and screening for its biosynthetic genes in marine soil bacteria
| Project/Area Number |
19K22266
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 38:Agricultural chemistry and related fields
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
山下 まり 東北大学, 農学研究科, 教授 (50192430)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2022-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2019)
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| Budget Amount *help |
¥6,240,000 (Direct Cost: ¥4,800,000、Indirect Cost: ¥1,440,000)
Fiscal Year 2021: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
Fiscal Year 2020: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
Fiscal Year 2019: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
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| Keywords | テトロドトキシン |
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| Outline of Research at the Start |
テトロドトキシン(TTX)はフグ毒として知られるが、海洋では他にカニ、タコなど、また陸上ではイモリ、カエルに存在する。起源生物は細菌としているが、どこで膨大なTTXが生産されるのか、なぜ、広範な生物が毒化するのかわかっていない。本研究は、日本でTTXが発生している地域の二枚貝や海底土壌を分析し、TTXが検出されるのか明らかにする。さらに、TTX陽性の土壌中微生物のDNAを抽出し、TTX生合成遺伝子を得ることに挑戦する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
テトロドトキシン(TTX)はフグ毒として知られるが、海洋では他にカニ、タコなど、また陸上ではイモリ、カエルに存在する。起源生物は細菌としているが、どこで膨大なTTXが生産されるのか、なぜ、広範な生物が毒化するのか、わかっていない。また、生合成遺伝子も未解明である。本研究は、東日本の湾で、浮遊物以外海底から直接アクセスするものがない、海水中に吊して養殖されたホタテガイを分析し、TTXが検出されるかどうかを調べた。ホタテガイは、4月から１２月まで定期的にサンプリングし、中腸腺から酸性水溶液で加熱抽出して、前処理後、麻痺性貝毒群（サキシトキシン群）とTTXをLC/MSで分析した。TTXは、養殖ホタテガイから極微量検出され、高分解能LC-MS/MSで完全に同定した。しかし、麻痺性貝毒は、中腸腺中で最高値182 micro mol/ kgであるが、TTXは最高値が421 nmol/ kgであり、TTXは麻痺性貝毒に比較して、非常に低濃度であることが示された。TTXの可食部中の濃度はEU食品安全委員会が定めた二枚貝中の可食部のTTXの基準値以下であった。最近、ヨーロッパやニュージーランドで、二枚貝中からTTXが検出された例は報告されているが、日本では、二枚貝からLC-MSでTTXを同定した例はなく、今回が初めてである。ホタテガイ中腸腺において、麻痺性貝毒の毒量のピークは5月下旬から6月下旬であったが、TTXは8月下旬から10月下旬にかけてピークを示した。ホタテガイの麻痺性貝毒の毒量のピークは、麻痺性貝毒生産渦鞭毛藻Alexandrium tamarenseの海水中の細胞密度とパラレルな関係が示されたが、ホタテガイのTTX濃度とは、関係が示されなかった。また、付近の海底土壌も継続的にサンプリングし、TTXを分析する方法を確立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、浮遊物以外海底から直接アクセスする生物がない、海水中に吊して養殖されたホタテガイを分析し、TTXが検出されるかどうかを調べた。ホタテガイは、4月から１２月まで定期的にサンプリングし、中腸腺から酸性水溶液で加熱抽出して、前処理後、麻痺性貝毒群（サキシトキシン群）とTTXをLC/MSで分析した。TTXは、養殖ホタテガイから極微量検出され、高分解能LC-MS/MSで完全に同定した。TTXの可食部中の濃度はEU食品安全委員会が定めた二枚貝中の可食部のTTXの基準値以下であることを明らかにした。このことは、食品衛生上重要な知見であると思われる。日本では、二枚貝からLC-MSでTTXを同定した例はなく、今回が初めてである。ホタテガイ中腸腺において、麻痺性貝毒の毒量のピークは5月下旬から6月下旬であったが、TTXは8月下旬から10月下旬にかけてピークを示した。ホタテガイの麻痺性貝毒の毒量のピークは、麻痺性貝毒生産渦鞭毛藻Alexandrium tamarenseの細胞密度とパラレルな関係が示されたが、ホタテガイのTTX濃度とは、関係が示されなかった。これらの成果は、論文にまとめて、Marine Drugsに報告した。また、付近の海底土壌や海水等も継続的にサンプリングし、サンプルを蓄積し、TTXを分析するための前処理方法やLCMS条件を検討し、確立した。このことから、順調に研究が進捗していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. 海底から離れた位置で養殖されている二枚貝からTTXをLC-MS/MSで完全にTTXを同定したため、これまで報告している推定TTX生合成中間体も存在するかどうか、分析する。
2. その二枚貝のTTX含量が増える時期の海水や、その中のプランクトン類および細菌をフィルターで集めて抽出し、TTXの有無を調べる。また、検鏡して優先プランクトンを識別する。
3. TTXが検出される二枚貝が養殖されている地点を中心に、周囲の海底堆積物（表層の土壌）を採集し、研究室で抽出してTTXの分析を蛍光HPLCとLC-MSで行う。
4. TTXが海水中のプランクトンや土壌から検出された場合は、さらに粒子径の分画を試みる。
5. TTXが検出された画分からDNAを抽出し、アミジノ転移酵素を指標にTTX生合成遺伝子をメタゲノム手法で探索する。
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Report
(1 results)
Research Products
(40 results)
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[Journal Article] Synthesis of C12‐keto saxitoxin derivatives with unusual inhibitory activity against voltage‐gated sodium channels2020
Author(s)
Kanna Adachi, Tomoshi Yamada, Hayate Ishizuka, Mana Oki,Shunsuke Tsunogae, Noriko Shimada, Osamu Chiba, Tatsuya Orihara, Masafumi Hidaka, Takatsugu Hirokawa, Minami Odagi, Keiichi Konoki,* Mari Yotsu-Yamashita,* Kazuo Nagasawa*
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Journal Title
Chemistry A European Journal
Volume: 26
Pages: 2025-2033
DOI
Related Report
Peer Reviewed
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[Journal Article] Metabolomic study of saxitoxin analogues and biosynthetic intermediates in dinoflagellates using 15N-labelled sodium nitrate as a nitrogen source2019
Author(s)
1.Cho, Y., Tsuchiya, S., Omura, T., Koike, K., Oikawa, H., Konoki, K., Oshima, Y., Yotsu-Yamashita, M.
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Journal Title
Scientific Reports
Volume: 9
Pages: 3460-3460
DOI
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Peer Reviewed / Open Access
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[Presentation] Identification of biosynthetic intermediates of amnesic shellfish toxin domoic acid and anthelmintic compound kainic acid2019
Author(s)
〇Maeno, Y., Kotaki, Y., Terada, R., Cho, Y., Konoki, K. and Yotsu-Yamashita, M.
Organizer
Gordon Research Conference, Mycotoxins and Phycotoxins
Related Report
Int'l Joint Research
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[Presentation] Metabolomic study of saxitoxin biosynthesis in dinoflagellates using 15N-labelled sodium nitrate as a nitrogen source2019
Author(s)
〇Cho, Y., Tsuchiya, S., Omura, T., Koike, K., Oikawa, H., Konoki, K., Oshima, Y. and Yotsu-Yamashita, M.
Organizer
Gordon Research Conference, Mycotoxins and Phycotoxins
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Int'l Joint Research
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[Presentation] Screening of novel secondary metabolites from microorganisms associated with the marine sponge Halichondria okadai2019
Author(s)
〇Goto, M., Kikuchi, S., Okada, K., Cho, Y., Yotsu-Yamashita, M. and Konoki, K.
Organizer
Tohoku University’s Chemistry Summer School
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[Presentation] Isolation and structural elucidation of tetrodotoxin related compounds from pufferfish2019
Author(s)
〇Yaegashi, Y., Ueyama, N., Kudo, Y., Cho, Y., Konoki, K. and Yotsu-Yamashita, M.
Organizer
Tohoku University’s Chemistry Summer School
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[Presentation] Crisprスクリーニングによる maitotoxin の標的分子探索（２）2019
Author(s)
角替俊輔,Katherine Chan,Amy Hin Yan Tong, Kamaldeep Kaur Aulakh, Andrea Habsid,八代田陽子,Jason Moffat,Charles Boone,山下まり, 村田道雄,〇此木敬一
Organizer
公益社団法人日本農芸化学会東北支部・第154回大会
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[Presentation] Crisprスクリーニングによる maitotoxin の標的分子探索（１）2019
Author(s)
〇角替俊輔,Katherine Chan,Amy Hin Yan Tong,Kamaldeep Kaur Aulakh, Andrea Habsid,八代田陽子,Jason Moffat,Charles Boone,山下まり,村田道雄,此木敬一
Organizer
公益社団法人日本農芸化学会東北支部・第154回大会
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