分泌性病原因子を用いた新規魚類寄生虫ワクチンの開発

Research Project

Project/Area Number	19K22336
Research Category	Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	Medium-sized Section 40:Forestry and forest products science, applied aquatic science, and related fields
Research Institution	Ehime University
Principal Investigator	北村真一愛媛大学, 沿岸環境科学研究センター, 准教授 (40448379)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	仲山慶愛媛大学, 沿岸環境科学研究センター, 講師 (80380286)
Project Period (FY)	2019-06-28 – 2022-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2019)
Budget Amount *help	¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000) Fiscal Year 2021: ¥2,730,000 (Direct Cost: ¥2,100,000、Indirect Cost: ¥630,000) Fiscal Year 2020: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000) Fiscal Year 2019: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
Keywords	スクーチカ症 / Miamiensis avidus / 病原性因子 / 細胞外プロテアーゼ / ワクチン
Outline of Research at the Start	多くの魚類寄生虫は生活史ごとに抗原性が変化するため、ワクチン開発は困難である。通常、ワクチンは病原体を抗原とするが、本課題では寄生虫が分泌する病原因子に注目し、ワクチンの開発を目指す。具体的には、ヒラメに被害をもたらす病原繊毛虫Miamiensis avidusの病原因子である分泌性プロテアーゼを分子レベルで特定し、それを大腸菌で大量合成し、魚類に免疫してワクチン効果を調べる。
Outline of Annual Research Achievements	スクーチカ症は海産繊毛虫Miamiensis avidusを病原体とする魚類寄生虫病の一つで、養殖魚や水族館で飼育されている観賞魚に甚大な被害を及ぼしている。有力な感染症対策としてワクチンがあるが、魚類の寄生虫病に対するワクチンは一つも商品化されていない。その理由として、多くの寄生虫には生活史が存在し、抗原性が変化すること、培養が困難であること、ゲノム情報が少なく組換えワクチンの開発が困難であることが挙げられる。これまでに申請者らは、本虫の細胞外プロテアーゼ（ECPs）が細胞を溶解することを見いだし、病原性因子の一つであることを明らかにした。このことから、分泌性の病原性因子を抗原としたワクチンが開発できるのではないかという発想に至った。本課題ではゲノム編集技術を応用し、病原性因子であるプロテアーゼ遺伝子を特定し、それを用いた世界初の魚類寄生虫のワクチンを開発することを目的としている。研究を大きく分けると、(1) 遺伝子発現解析によるワクチン候補となるECPsの探索、(2) ゲノム編集のためのゲノム解析、(3) ゲノム編集によるECPs遺伝子のノックアウト、(4) 変異株の病原性の確認、（5）ワクチン開発となる。昨年度は、(1) 網羅的遺伝子発現解析を行うために、どのグロースフェーズでECPsを分泌しているのかを調べた。魚類株化細胞に対する細胞毒性を指標として、M. avidus培養0日目-7日目までのECPs活性を測定した。その結果、培養4日目以降（10^5 虫体/mL以上）に高いECPs活性が認められた。また、(2) ゲノム編集を行うために必要なゲノム解析も行った。その結果、164個のペプチダーゼが検出された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 事業計画のうち、Miamiensis avidus 3株のゲノム解析は終了し、多くのプロテアーゼ遺伝子の検出に成功した。また、本虫がどのグロースフェーズで細胞外プロテアーゼを分泌しているのかを明らかにできたことから、遺伝子発現解析を実施するための基礎的知見は十分に得られたと言える。遺伝子発現解析には至らなかったものの、サンプル準備をすれば何時でも開始できる状態にあり、概ね順調に研究が進んでいると判断した。
Strategy for Future Research Activity	昨年度の結果から、M. avidusが10^5 虫体/mL以上になると、十分に細胞外プロテアーゼを分泌することが明らかになった。そこで、本年度は、10^5 虫体/mLと10^6 虫体/mLの2タイムポイントで本虫のサンプリングを行い、定法により次世代シーケンサーで網羅的遺伝子発現解析を行う。得られた結果からプロテアーゼ遺伝子を抽出、発現量をランキング付けし、病原性因子の候補遺伝子を決定する。ターゲット遺伝子を決定後、昨年度得られたゲノム解析の結果に基づいて、ゲノム編集実験を行い、プロテアーゼ遺伝子をノックアウトする。