Development of a novel strategy toward bovine mastitis using an insect antimicrobial peptide

• Project/Area Number: 19K22357
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Medium-sized Section 42:Veterinary medical science, animal science, and related fields
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 米山 裕 東北大学, 農学研究科, 教授 (10220774)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 安藤 太助 東北大学, 農学研究科, 助教 (40250732)
• Project Period (FY): 2019-06-28 – 2021-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2019)
• Budget Amount: ¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000); Fiscal Year 2020: ¥3,120,000 (Direct Cost: ¥2,400,000、Indirect Cost: ¥720,000); Fiscal Year 2019: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
• Keywords: 抗菌ペプチド / 乳房炎 / 黄色ブドウ球菌

Outline of Research at the Start

家畜生産のために使用される抗生物質の量は人の医療用としての用途よりも多く、この過剰な家畜への抗生物質の使用は薬剤耐性菌出現の温床となることから、その使用量の低減化は畜産業の持続的な発展のみならず、人類社会のために解決しなければならない喫緊の課題である。本研究では、酪農現場で最も経済的損失の大きい乳房炎の新規防除法の開発を目指し、既存の抗生物質に比べ耐性菌出現頻度の非常に低い抗菌ペプチドに注目し、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌に有効なマダニ抗菌ペプチドの微生物宿主を用いた高発現系の構築と、野生型ペプチドより抗菌力の増強した誘導体の探索を行う。

Outline of Annual Research Achievements

家畜生産のために使用される抗生物質の量は人の医療用としての用途よりも多く、この過剰な家畜への抗生物質の使用は薬剤耐性菌出現の温床となることから、その使用量の低減化は畜産業の持続的な発展のみならず、人類社会のために解決しなければならない喫緊の課題である。本研究では、酪農現場で最も経済的損失の大きい乳房炎の新規防除法の開発を目指し、既存の抗生物質に比べ耐性菌出現頻度の非常に低い抗菌ペプチドに注目し、中でもメチシリン耐性黄色ブドウ球菌に有効なマダニ由来抗菌ペプチドの微生物を宿主とした高発現系の構築を初年度に実施した。マダニペプチドpersulcatusinの野生型遺伝子を、タバコエッチウイルスのプロテアーゼTEVの基質認識配列をコードするDNA配列を介してマウスのカルモデュリン遺伝子と融合させたキメラ遺伝子を構築し、この組換え型遺伝子を組み込んだ高発現ベクターを大腸菌に導入した形質転換体の作出に成功した。次いで、融合タンパク質の発現誘導を行った後、細胞を破砕して得た可溶性画分のタンパク質試料をSDS-PAGE電気泳動解析した結果、予想される分子量(24.4 kDa)に相当するタンパク質の高発現が認められた。その後、Ni-NTAレジンを用いたアフィニティー精製を行った結果、一段階の精製ステップで融合タンパク質の部分精製に成功した。さらに、取得した部分精製サンプルをTEVプロテアーゼ処理したところ、基質認識部位の切断は未だ不十分であったが、電気泳動解析の結果、persulcatusinの分子量に相当する4,200 Daのペプチドが遊離していることが明らかとなった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究課題初年度実施予定であったマダニペプチドの自然免疫を担う抗菌ペプチドpersulcatusinの大腸菌を宿主とした高発現系を構築するために、マウスのカルモデュリンとpersulcatusinのキメラタンパク質遺伝子の設計を行った。その際、融合タンパク質を部位特異的プロテアーゼTEVで切断し、タグとして用いたカルモデュリンからpersulcatusinを分離精製するためのリンカー配列（ENLYFQ）を挿入したキメラタンパク質とした。このキメラタンパク質をコードする人工合成遺伝子を大腸菌の高発現ベクターであるpET15bに挿入した組換えプラスミドを大腸菌BL21(DE3)に形質転換し、IPTG誘導後、菌体を破砕した可溶性画分のタンパク質をSDS-PAGE電気泳動にて解析した結果、キメラタンパク質の予想される分子量（24.4 kDa）に相当するタンパク質の高発現を確認することができた。次いで、Ni-NTAレジンを用いたアフィニティー精製を行ったところ、一段階の精製ステップでコンタミしたタンパク質は依然存在するものの大量の融合タンパク質を精製することができた。また、この部分精製した融合タンパク質をTEVプロテアーゼで切断処理した結果、完全分解の条件には至らなかったが、遊離のpersulcatusinを生成することに成功した。以上より、本研究課題の第一段階の目標である大腸菌を用いたpersulcatusinの生産系の構築に成功し、次年度の活性評価、活性に及ぼすアミノ酸置換誘導体の探索研究の基盤ができたことから、おおむね本研究課題は順調に進展している。

Strategy for Future Research Activity

2019年度の研究で、大腸菌を宿主としたpersulcatusinの高発現系およびTEVプロテアーゼ切断によって遊離のpersulcatusin産生系を構築することに成功した。そこで、令和2年度の研究において以下の研究課題を遂行する。(1)アフィニティー精製によりpersulcatusinを部分精製することができたので、形質転換体を大量培養して融合タンパク質を取得し、TEVプロテアーゼ切断した標品を、Ni-NTAレジン精製とゲル濾過精製、さらにDEAEカラム精製を組み合わせることによって高度に精製したpersulcatusinを取得する。(2)精製したpersulcatusinの黄色ブドウ球菌標準株とMRSA株（S. aureus JE2）に対する抗菌活性をディスク拡散法とミクロダイリューション法によるMIC測定を行い評価する。(3)野生型persulcatusinの抗菌活性を検証した後、38アミノ酸残基からなるpersulcatusinの6つのシステイン残基を個々にアラニンに置換した変異型persulcatusinを構築し、それらの抗菌活性に及ぼす影響を検討することに加え、抗菌ペプチドの活性に重要であることが知られている陽性荷電アミノ酸（アルギニン、リジン）の置換誘導体を作出し、それらの抗菌活性に及ぼす影響を評価する。(4)さらに、野生型persulcatusinの中性アミノ酸残基をアルギニンまたはリジンに置換した各種置換誘導体を構築し、それらの活性を評価して野生型persulcatusinより活性の高い、あるいは性状（安定性など）の改善した誘導体の探索を行う。