金ナノ粒子とレーザー光を利用した受精卵の分化制御機構の解明

• Project/Area Number: 19K22364
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Medium-sized Section 42:Veterinary medical science, animal science, and related fields
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 南 直治郎 京都大学, 農学研究科, 教授 (30212236)
• Project Period (FY): 2019-06-28 – 2022-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2020)
• Budget Amount: ¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000); Fiscal Year 2021: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000); Fiscal Year 2020: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000); Fiscal Year 2019: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
• Keywords: 初期胚 / 遺伝子発現 / 金ナノ粒子 / 分化制御 / HSPプロモーター / 受精卵 / 遺伝子導入 / 割球の運命決定

Outline of Research at the Start

受精卵の細胞分裂は最初は空間的な位置関係も含め均等に起こるが、数回後の分裂からは細胞の位置や役割は均一ではなくなる。着床前には将来胎仔になる細胞と将来胎盤になる細胞に分化するが、この分化がいつどのようにして起こるのかは分かっていない。本研究では、受精直後の胚に金ナノ粒子と温度上昇により遺伝子発現を誘導できるプラスミドDNAを取り込ませ、細胞分裂が進んだ時点で受精卵の特定の割球にレーザー光を照射することで、金ナノ粒子を振動させその割球の温度を上昇させる。温度が上昇した割球で分化誘導を制御するエピジェネティックな修飾に関わる遺伝子を発現させ、受精卵で起こる最初の分化の制御機構を明らかにする。

Outline of Annual Research Achievements

昨年度は、ヒートショックタンパク質(HSP)プロモーターの下流にGFPをコードしたプラスミドDNAをマウス1細胞期胚に顕微注入し、4細胞期で43℃の熱処理を行った結果、4細胞期以降の発生ステージにおいて割球間で蛍光強度に不均一性がみられた。原因として、プラスミドDNAが核内ではなく細胞質に局在してしまっている可能性が考えられたため、本年度はpiggyBacトランスポゾンを用いて1細胞期胚のゲノムにHSPプロモーター配列を取り込ませることを試みた。コントロールとしてCMVプロモーターの下流にGFPをコードしたpiggyBacプラスミドを顕微注入した結果、目的配列が受精卵ゲノムに正常に取り込まれることは確認することができた。一方、CMVプロモーターをHSPプロモーターに置き換えたプラスミドを顕微注入した結果、熱処理を行わない胚でもGFPが発現してしまうことが明らかとなった。また、昨年度はDOTAP被覆した金ナノ粒子(DOTAP-AuNRs)は培地に添加しただけではマウス受精卵には取り込まれないことがわかったため、今年度はマウス受精卵に直接DOTAP-AuNRsを顕微注入した。Rhodamine-PEで蛍光標識したDOTAP-AuNRsを顕微注入したところ、蛍光が確認される濃度でDOTAP-AuNRsを導入した場合は、受精卵の発生率が低下することが確認された。また、顕微注入の際に、顕微注入用の針の壁面にDOTAP-AuNRsが付着するため、導入量の調整は技術的に困難であった。DOTAP-AuNRsは分散性が比較的悪く、細胞毒性も強いことが予想されたため、PVPでコーティングされた金ナノ粒子(PVP-GNS: Gold NanoShells)を用意し、受精卵への顕微注入を行った。PVP-GNSを顕微注入した受精卵では、発生率の低下は観測されなかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度の研究により、マウス受精卵へのDOTAP-AuNRsの顕微注入は発生率を低下させること、あるいは物質の性質上初期胚への導入量の調節が困難であることが明らかとなった。しかし、DOTAP-AuNRsの代替としてPVP-GNSを用いることで発生率を低下させることなく金粒子を導入することが可能であることが明らかになった。また、piggyBacによるHSPプロモーターのゲノムへの挿入は、熱処理を行わない初期胚でもGFPを発現してしまうことがわかった。原因としてDNA切断によるストレスが考えられるため、現在ROSA26領域にあらかじめHSPプロモーターとGFPをノックインしたマウスを作成中であり、ノックインマウスの受精卵を用いて熱処理実験を行う予定である。これらの実験が終わり次第、レーザー顕微鏡を用いて4細胞期の1割球のみを過熱し、導入した遺伝子が発現することを確認する。

Strategy for Future Research Activity

HSPプロモーターをコードするpiggyBacプラスミドを顕微注入した結果、熱処理を行わない初期胚でもGFPが発現することが観察された。原因としては、トランスポゾンがゲノムに挿入される際にDNAの切断を引き起こすため、piggyBacによって初期胚にストレス反応を誘導した可能性が考えられる。今後はROSA26領域にHSPプロモーターとGFPをコードした配列をノックインしたマウスを作製し、その精子および卵子を用いて受精卵を得て熱処理実験を行い、HSPプロモーターの有効性を確認する。次に、受精卵の発生に悪影響の少ないPVP-GNSを顕微注入しレーザーを用いて加熱処理を行い、PVP-GNSの有効性を検討する。以上の実験により、HSPプロモーターとPVP-GNSの有効性を確認した後、HSPプロモーターの下流にヒストンアルギニンの修飾酵素であるCarm1を接続した遺伝子を構築し、この遺伝子とPVP-GNSを導入した受精卵を4細胞期に発生させた後、単一割球をレーザーにより加熱し、Carm1を過剰発現させ、その割球が胎盤に寄与するか胎子に寄与するかを観察する。