基質の性状とそれに制御されるmiRNAを用いた統合的な卵子胚培養システムの開発
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19K22372
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 42:Veterinary medical science, animal science, and related fields
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture |
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Principal Investigator |
岩田 尚孝 東京農業大学, 農学部, 教授 (50385499)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2022-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2019)
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| Budget Amount *help |
¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
Fiscal Year 2020: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
Fiscal Year 2019: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
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| Keywords | 多糖軟質ゲル / 卵子発育 / 胚発生 / Hippoシグナル / 胚 / 培養基質 / 多糖類 / 細胞外核酸 |
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| Outline of Research at the Start |
卵子や胚の培養は生殖工学や生殖医療の基盤技術である。これらの技術は硬いシャーレ上での培養から得た知見を集約したものであり、現行の培養技術では、体内から回収した卵や胚と同等のものは作成できない。一方、体内環境には、大量の支持細胞、柔軟な基質そして体液に溶けた生理活性物質やエクソソームがある。申請者は安全で簡便に調整できる植物由来の多糖類を用いて柔らかい基質を作製し、この新基質を用いて、細胞の性状変化を誘起し、これに応じて分泌されるエキソソームmiRNAを調べ、基質と培養環境を含む統合的な新培養システムを開発する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
最初にキサンタンガムとロ－カストビンガムの組み合わせで軟質ゲルを作成し、卵子の体外培養を試みた。卵子と顆粒層細胞の複合体であるoocyte-granulosa cells complexes(OGCs)をブタの初期胞状卵胞から回収しゲル上にて体外で培養した。これまで最も良好な卵子の体外発育が得られていた既存のポリアクリルアミドゲル培養法と比較したところ多糖軟質ゲルは顆粒層細胞の生存率を有意に改善し、体外で発育した卵子の胚盤胞期胚への発育が高かった。また卵子の発育に伴い向上するヒストンのアセチル化状態も高い胚が作成できた。次にこの良好な軟質基質の分子背景を明らかにするために、OGCsをウシ卵巣から回収し、プラスチック上とゲル上で培養し,ゲル基質が卵子の体外発育やその質を改善するという良好な培養成績を得ている。これらの顆粒層細胞から回収したRNAを用いてRNAseqを行い、プラスチック上の培養から得た対象区と比較するとHippo-Yapシグナルの活性化が確認できている。現在これらの結果を確認し卵子の能力を検討している。また卵管液からエキソソームを分画しsmallRNAseqを行い結果を解析中である。胚を硬質、軟質（体内）で発育させ両者のRNAseqから変動遺伝子を同定できた。これらから上流因子としてのmiRNAを推測しておりこれと卵管中にあるmiRNAの重なりを比べる予定である。胚の培養環境にゲルの基質を外挿したところ、胚の胚盤胞期胚までの発育が有意に改善する結果を得ている。またRNAseqの結果を参考に免疫染色にて細胞と同経路が活性化しているという結果を得ている。またマイクロRNAの外挿試験を行うために、ウシの初期胚の透明帯の有無といった培養条件や、添加するmimicの濃度を決める培養試験を行い、条件を決定することができた。また既報から採用したマイクロRNAの外挿試験で胚発育を刺激する事ができることも明らかにしている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の予定どおり卵子の体外発育や胚の体外発育を軟質なゲルは有意に改善した。さらにゲル上で発育した卵子の発育能力改善については多岐にわたる評価を行うことができた。さらに効果をウシやブタ二つの動物種で確認できた。回収した細胞を用いたRNAseqでは多くの変動遺伝子を同定でき、これらから上流因子を推測したところ予定どおりHippo-Yapシグナルが大きく関与していることが分かった。さらに胚の体外培養に対してゲルを用いた実験でもHippo-Yapシグナルと細胞骨格を介して胚発生が促されていることが明らかになったため、当初の予定を変更することなく実験を進めることができている。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は、卵子顆粒層細胞の体外培養では、ゲルとプラスチックシャーレ上での比較をRNAseq調べたデータを用いて上流因子としてのマイクロRNAを同定する。また細胞の培養液を回収してそこからエキソソーム分画を回収しsmallRNAseqを実施中であり、この二つの集団の重なりからゲル特異的なmiRNAを推測する。得られたmiRNAの多少はRT-PCRを用いて評価できるため、ゲルの有無、濃度などの条件が影響するのかを確認する。候補が決まればこれらを培養条件に外挿し卵子の発育に及ぼす影響を観察する予定である。
また、胚の培養にゲルが及ぼす影響とその分子背景を、上記のRNAseqのデータを参考に蛋白と遺伝子発現レベルで検証し、ゲルの胚発生に及ぼす影響を評価する。また卵管の上皮に含まれるmiRNAをsmallRNAseqで同定を試みる。ゲル上で卵管上皮を培養したときにこれらの候補miRNAの濃度が変化するのかを確認する。候補miRNAは胚の培養条件に外挿する予定である。
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Report
(1 results)
Research Products
(3 results)
