イセエビ幼生が平面構造から３D形態へ変化する原理の解明

• Project/Area Number: 19K22428
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Medium-sized Section 44:Biology at cellular to organismal levels, and related fields
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 近藤 滋 大阪大学, 生命機能研究科, 教授 (10252503)
• Project Period (FY): 2019-06-28 – 2022-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2020)
• Budget Amount: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000); Fiscal Year 2021: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2020: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000); Fiscal Year 2019: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
• Keywords: イセエビ / 幼生 / 脱皮 / フィロゾーマ / クチクラ / ３D形態形成 / 折り紙 / 変態 / 甲殻類

Outline of Research at the Start

イセエビの幼生は、1回の脱皮で、２次元平面から3次元形状に変態する。脱皮前後のクチクラの構造を電顕で詳しく解析することにより、クチクラの各地点での収縮率、収縮の異方性を測定し、それを幼生の平面上クチクラ形状にマップする。次にその平面情報から、収縮後の立体構造を、計算機により3次元物理計算から導き出す。成功すれば、平面の構造から、任意の3次元構造を瞬時に作り出す新しい技術が生まれる可能性がある。

Outline of Annual Research Achievements

前年に、約2個体の最終齢幼生のサンプルを得て、クチクラの形状の解析を行った。しかし、クチクラに目だった折り畳みは発見されず、変形の原因解明には至らなかった。そのため、今年度は、もっと多数の、脱皮途中のサンプルを入手すべく、前年度よりも、ふぃろざーまの飼育環境の改善に努めた。協力してくれている三重県水産研が資金不足であるため、研究費の多くを、フィロゾーマの飼育を行う大型回転水槽とポンプに使わせていただいた。
装置の改善と、研究協力鎖の献身的な作業により、2020年度の年明けから、かなりの数のフィロゾーマが育ち、サンプル収集が可能な状態になった。
最も必要なサンプルは、脱皮直前、脱皮の前半期、脱皮の後半期、脱皮直後（プエルルス）である。それぞれを最低2個体づつ確保することを目的に、三重に出張し、脱皮変態する個体を順次固定した。現在までに少なくとも、直前の個体２，変態期前期と後期が数個体ずつ、直後の個体３を採集することに成功している。これらは順次、CTと電顕により形態を詳細に観察し、その結果を物理シミュレーションで解析することで、変形の原理を探っていく（来年度の予定）
また、脱皮途中の個体を、拡大してライプ撮影することで、おおよその変化の過程を推定することができた。一番意外だったのは、脱皮直後のプエルルスの外殻が、成熟したもののように薄板になっておらず、厚みのある曲面になっていることであった。これまでクチクラの変形は、主に折り畳みの展開によって起こっていると仮定して研究を進めてきたが、それに加えて、厚みの変化（それと同時に起きる延展）を考慮する必要があることが解った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初から最も危惧されたのは、脱皮途中のサンプルを手に入れられるかどうかであった。2019年度は、飼育状態が極めて悪く、水産研全体でも、2匹しか変態個体を得られないというひどい状態であり、その中でもその2個体をいただくことができたのは、幸運であった。不作の原因は、野生動物であるため、解っていない。幸い、２０２０年度の飼育により、少なくとも最低限の数は手に入れることができたので安堵している。今年のサンプルで、脱皮過程の個体を、拡大撮影することができ、その画像から、大まかな変形のプロセスの予想がついたことが、重要である。
フィロゾーマは、頭部、胸部、腹部が分離しており、頭部は胸部の前方に存在する。また両者は、頭部と胸部が重なった領域にある口の部分でつながっている。しかし、プエルルスになると、胸部と頭部が一体化する。フィロゾーマの頭部が背側に、胸部が腹側になることで、前後の並びが背腹の並びになる。この過程で、接続部の形態がどのようになるのかが、今後の形態変化の理解にきわめて重要であろう。変態途中のサンプルは複数確保しているので、そのあたりを重点的にして画像解析を行いたい。
サンプルはある程度確保されたが、今後もそれが供給される可能性が少ないことが解っている。三重県が、イセエビ研究の終止を決めたため、今後、フィロゾーマの飼育は行われない。現在手に入れたサンプルのみで、これからの解析を終わらせる必要があるため、サンプルは、複数の解析（電顕、CT、ミクロトーム）に使えるように、注意深く使っていく予定である。

Strategy for Future Research Activity

サンプルが得られたので、今後は、変態過程の各ステップにおける３Dデータの取得と、そのデータに基づいた変態原理の解明を進める。
まず、マイクロCTにより、全体の３Dデータを取得し、変態における大まかな変形の概要を知る。特に、頭部と胸部の位置関係が、前後から背腹に移行する過程が重要であり、できればその過程を、CGで再現することを目的としたい。次に、マイクロCTにかけたサンプルをそのまま使い電顕により、より詳細な形態データを取得する。マイクロCTの解像度では、クチクラ表面の細かい形状は完治することができない。しかし、細かい形状は、クチクラにおける「位置」の基準点となる。変態過程で、それらの基準点の間の距離の変化を測定することで、クチクラの伸びと縮みを観測できるはずである。最期に、CTや電顕に使用していないサンプルを使い、連続凍結切片画像の再構成により、クチクラではなく、クチクラを分泌する上皮細胞層の形態データを取得する。変態期のクチクラは非常に薄く、また、クチクラそのものには、異方性の収縮をもたらす物理力が見いだせない。そのため、物理力の発生には、細胞の中にあるアクチン収縮が関与している可能性を考えている。そのため、Fアクチンをファロイジン等で染色可視化することで、その配向を知り、変形の力として働いているかどうかを確認する。
上記の実験結果から、数理モデルを作り、変態の過程を計算機上で再現することが最終的目標である。数理モデルに関しては、変形の主要因が、折り畳みの展開であるか、あるいは伸展と収縮であるか、あるいはそれ以外であるかにより異なってくるため、現時点では数理モデルづくりは開始していない。しかし、折り畳みの場合には既にカブトムシのプロジェクトで作成したモデルを使うことができるし、進展と収縮の場合も、同じプログラムを改変することで対応できるので、準備は整っている。