mRNAでオンになるスイッチ分子の開発と脳発生解析における応用

• Project/Area Number: 19K22441
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Medium-sized Section 44:Biology at cellular to organismal levels, and related fields
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 下向 敦範 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 専門職研究員 (00442971)
• Project Period (FY): 2019-06-28 – 2021-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2019)
• Budget Amount: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000); Fiscal Year 2020: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000); Fiscal Year 2019: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
• Keywords: mRNAターゲティング / Cas13 / 分子スイッチ / 脳発生 / 細胞多様性

Outline of Research at the Start

本研究では、特定のmRNAを特異的に認識するスイッチを、相補的なガイドRNAにより狙ったRNAをターゲット可能なクリスパーCas13システムを利用して、1年目に、培養細胞を用いた開発と、2年目に、マウス、フェレットを用いた、生体内で特定の細胞を追跡、操作する実証実験を行う。最終的に、遺伝子組換え動物作成の困難な生物でも、ゲノムDNAを操作することなく、特定の細胞種を操作する、安全で、汎用性の高いツールの開発を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

生体を構成する多様な細胞群は、多くは遺伝子発現の違いによって識別が可能である。これらの違いを捉えるのに、ミニプロモーターやレポーターなどのゲノムへの遺伝子組換え技術利用されてきた。近年、CRISPR/Cas9などの簡便なゲノム編集技術の普及により、様々な種で遺伝子組み替え操作が可能となってきた。しかし、DNAをターゲットとする場合、不可逆的にゲノムに変異を生じる可能性を排除することはできない。そこでRNAをターゲットとする技術が注目されつつある。Cas13酵素群は、ターゲットに相補的なガイドRNA(gRNA)配列を介して、狙ったmRNAに結合し作用するDNA編集に利用されるCas9のRNA版である。Cas13の不活性型は、狙ったmRNAに結合する事が可能であり、mRNAの編集や、可視化に利用されている。そこで、二つのCas13に分割した転写因子を融合し目的のmRNAの存在によりスイッチをオンする分子の開発を試みた。
スイッチを構成する分子として、自己会合能の低い出芽酵母のVMAインテイン、転写リークの少ないTetON変異体、分割して再構成すると核移行シグナルとして機能するsplit NLSを用いて、二つに分割した転写因子部分を構築した。これらを3種類のCas13dタンパク質のN末または、C末に融合させ、核外移行シグナルよって再構成前は転写因子として作用しないように設計した。これらをgRNAの有無の条件でTetレポーターの発現を指標に評価を行った。
予想されたようにgRNAがなくてもレポーターの活性が見られた事から、非特異的に転写因子の再構成が起きていると予想された。しかし、全く活性が無ければスイッチの設計の再考が必要だったが、スイッチ部分の構築のステップはクリアしたと考えられる。これから如何に非特異的な活性を下げていくのかに焦点を当てて、研究を続けてゆく予定である。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

転写因子TetONを再構成する部分の分子の選定、設計、それらのソースの取得とDNA構築に想定より時間がかかり、実際に活性を測定する段階に到るまでに時間を要してしまった。また、新型コロナウイルスの感染拡大により、所属機関のロックダウンが実施され、継続的に培地交換や植え継ぎの作業が必要な培養細胞でのアッセイ系の立ち上げを延期せざる得ない事態になり、構築したスイッチ部分のアッセイとシステム全体の評価系の実験が大幅に遅れることとなった。
しかしながら、ロックダウン前に、直前まで入手可能であったマウス胎児へのエレクトロポーレーションを用いたin vivoアッセイにより限定的であるが、システムの評価をある程度可能とする実験データを得ることができた。
その結果、当初予想した通り、二つに分割したスイッチを導入するだけで、レポーターからのリーク的な発現が確認された。この事は、逆を返せば、二つに分割された転写因子の再会合が上手くいっているとも考えられた。また、ターゲットmRNAに対するgRNAを導入した場合、リーク以上のレポーターの発現が見られるか確認したが、全体的に大きな違いは観られなかった。しかしながら、詳細に解析したところ、弱いレポーターの発現がgRNAの有無に伴って、上昇している事が確認された。今回、3種類のCas13dタンパク質について、解析を行なったが、gRNA依存的に発現の変化がみられたのは、CasRXのみで、他のEsCas13d, RspCas13dについては、殆どの違いが判らなかった。これらの結果は、哺乳類の細胞で、実用的な活性を持っているのがCasRXだけであるとの報告が多数ある事とも一致する。強い発現を伴うリークに関しては、Cas13タンパク質は、哺乳細胞内で凝集しやすい事が報告されているので、非特異的な分子の近接化がリークの主要因ではないかと推察される。

Strategy for Future Research Activity

限定的なデータから、これから解消しなければいけない課題として、非特異的な活性の抑制、哺乳類の細胞で活性のあるCas13dまたは、他のRNA結合型のCasタンパクとの組み合わせを検討していくと事が必要であると考えられる。また、今後、新型コロナウイルスの感染拡大による所属研究所のロックダウンの有無に関しては、依然不透明であり、再ロックダウンとなった場合に備えて、実験の計画を変更せざる得ないと考えられる。具体的には、継続的な維持管理が必要な培養細胞形でのアッセイ系の構築について、準備しつつも、マウスを使ったin vivoのアッセイをメインに行なっていく事にする。理由としては、あくまで本研究は、in vivoでの利用を目的としており、培養細胞だけで利用できても、他の手法と比べて、大きなアドバンテージがあるわけではなく殆ど意味を見出さないからである。一方で、どうしても多くの数を条件検討をするという点においては、大きく後退する。そこをカバーするために、全体の研究計画の延長の可能性も検討する。また、RNAをターゲットするCasタンパク質に関しても、実際にin vivoに適用可能なものは、世界的な競争によりかなり選別されてきている。その為、実際に検討する組み合わせは、爆発的に増えないと考えられる。
今後の方針としては、gRNA依存性をより明確に示すようなRNAターゲット型Casタンパク質の組み合わせての選別と、非特異的なスイッチ部分の再構成を分割したスイッチ分子のそれぞれの局在を詳細に調べる事により、適切な場所に局在化させたり、凝集などの非特異的な局在異常がないか検討していきたいと考えている。