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生体内において自由自在にNotchシグナルの強弱を変化させる分子ハンドルの創生

Research Project

Project/Area Number 19K22490
Research Category

Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)

Allocation TypeMulti-year Fund
Review Section Medium-sized Section 47:Pharmaceutical sciences and related fields
Research InstitutionNagoya University

Principal Investigator

竹内 英之  名古屋大学, 医学系研究科, 准教授 (80361608)

Project Period (FY) 2019-06-28 – 2022-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2020)
Budget Amount *help
¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2020: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
Fiscal Year 2019: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
KeywordsO-グルコース糖鎖 / Notch シグナル / 糖転移酵素 / ケミカルバイオロジー / Notchシグナル / O-グルコース糖鎖修飾 / 低分子阻害薬
Outline of Research at the Start

応募者は、Notch の細胞外部位における糖鎖修飾が、その活性化に重要な役割を果たしていることを明らかにしてきた。O-グルコース糖鎖の付加は、Notch の活性化に必須である一方、O-グルコース糖鎖のキシロースによる伸長は、Notch の活性化を抑制する。肺、食道、および頭頸部由来扁平上皮癌を含む、多くの癌で XXYLT1 の増幅がみられ、このことが発癌に関与している可能性がある 。本研究では、O-グルコース糖鎖合成を担う糖転移酵素 (POGLUT1、GXYLT1、GXYLT2、XXYLT1) に照準を定め、それらの低分子阻害薬を探索する。

Outline of Annual Research Achievements

Notch シグナル伝達経路は、進化的に非常によく保存された、多細胞生物個体における細胞の運命決定に重要な役割を果たす細胞間情報伝達経路である。例えば、ショウジョウバエでは神経細胞や翅の発生分化、また、哺乳類においては、発生過程の体節形成、胸腺における T 細胞分化や腸管上皮幹細胞の自己複製と分化など、様々な生物学的プロセスを制御している。また、Notch シグナルの破綻は癌の発生、悪性度の進展、転移に関わっている。多くの種類の癌で Notchシグナルの異常な亢進が観察される一方、急性骨髄性白血病や扁平上皮癌など、ある種の癌では、Notch シグナルの低下が発癌と悪性度の進展に関与している。
研究代表者は、Notch の細胞外部位における糖鎖修飾が、その活性化に重要な役割を果たしていることを明らかにしてきた。O-グルコース糖鎖の付加は、Notch の活性化に必須である一方、O-グルコース糖鎖のキシロースによる伸長は、Notch の活性化を抑制する。肺、食道、および頭頸部由来扁平上皮癌を含む、多くの癌で XXYLT1 の増幅がみられ、このことが発癌に関与している可能性がある。本研究では、O-グルコース糖鎖合成を担う糖転移酵素に照準を定め、それらの低分子阻害薬を探索する。
このような目標を達成するために、本年度は、タンパク質O-グルコース転移酵素POGLUT1を対象として、化合物ライブラリーを用いたハイスループットスクリーニングのアッセイ系を構築した。さらに、キシロース転移酵素の活性が、同様のアッセイ系で測定できることも確認した。
Notch受容体機能の糖鎖修飾による制御機構に関する原著論文4報、並びに、英文総説1報の発表に貢献した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

タンパク質O-グルコース転移酵素POGLUT1を対象として、東京大学創薬機構の支援を受け、化合物ライブラリーを用いたハイスループットスクリーニングのためのアッセイ系を構築した。このためには、糖転移酵素、UDP-グルコースなどのドナー糖ヌクレオチド、EGF リピートなどのアクセプターからなる in vitro での糖鎖付加反応系を確立する必要があった。HEK293T 細胞に発現ベクターを一過性導入し、培地を採取し、Ni-NTA アフィニティークロマトグラフィーで糖転移酵素を精製することにより、組換えヒトPOGLUT1タンパク質を発現、精製した。また、pET大腸菌発現系を用いて、O-グルコースコンセンサス配列を有する、マウスNOTCH2EGF12に相当するEGFリピートを発現させ、Ni-NTAアフィニティークロマトグラフィーおよび逆相(RP)HPLCによりさらに精製した。最後に、RP-HPLCおよびLC-MSを用いた反応産物の分析により、EGFリピートがin vitro での糖鎖付加反応で糖転移酵素POGLUT1によりO-グルコース糖鎖で修飾されていることを確認した。そして、約1万化合物のスクリーニングを行い、POGLUT1に対して阻害作用を示す約50種類の化合物を得た。一方、興味深いことに、POGLUT1の酵素活性を亢進させる化合物も2種類得た。
さらに、三次元立体構造解析のためのグルコシドキシロース転移酵素 GXYLT1 の作製も上と同様の方法で行った。また、POGLUT1の酵素活性測定系が、本酵素についても適用可能であることが確認された。しかしながら、化合物スクリーニングの実施には至らなかった。

Strategy for Future Research Activity

ここまでに構築した化合物ライブラリーを用いたハイスループットスクリーニング系を用いて、Notch受容体を修飾する糖転移酵素POGLUT1、GXYLT1、GXYLT2、XXYLT1の阻害剤候補をさらに探索する。最初のスクリーニングでPOGLUT1に対して阻害活性が見られた化合物については、培養細胞を用いた Notch レポーターアッセイを行う [Rana et al. 2011 J Biol Chem]。Jafar-Nejad 博士がショウジョウバエ個体を用い Notch シグナルに対する影響を調べる [Lee et al. 2017 Plos Genetics]。
既報と同様に、作製したGXYLT1の基質との複合体の結晶構造解析を遂行する [Yu、 Takeuchi et al. 2016 Nat Chem Biol] [Takeuchi (correspondence)et al. 2015 Nat Chem Biol]。

Report

(2 results)
  • 2020 Research-status Report
  • 2019 Research-status Report

Research Products

(17 results)

All 2021 2020 2019

All Journal Article (10 results) (of which Int'l Joint Research: 4 results,  Peer Reviewed: 10 results,  Open Access: 6 results) Presentation (6 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Invited: 3 results) Book (1 results)

  • [Journal Article] Current Views on the Roles of O-Glycosylation in Controlling Notch-Ligand Interactions2021

    • Author(s)
      Saiki Wataru、Ma Chenyu、Okajima Tetsuya、Takeuchi Hideyuki
    • Journal Title

      Biomolecules

      Volume: 11 Pages: 309-309

    • DOI

      10.3390/biom11020309

    • Related Report
      2020 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Bioinformatics and Functional Analyses Implicate Potential Roles for EOGT and L-fringe in Pancreatic Cancers2021

    • Author(s)
      Barua Rashu、Mizuno Kazuyuki、Tashima Yuko、Ogawa Mitsutaka、Takeuchi Hideyuki、Taguchi Ayumu、Okajima Tetsuya
    • Journal Title

      Molecules

      Volume: 26 Pages: 882-882

    • DOI

      10.3390/molecules26040882

    • Related Report
      2020 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Differential Labeling of Glycoproteins with Alkynyl Fucose Analogs2020

    • Author(s)
      Ma Chenyu、Takeuchi Hideyuki、Hao Huilin、Yonekawa Chizuko、Nakajima Kazuki、Nagae Masamichi、Okajima Tetsuya、Haltiwanger Robert S.、Kizuka Yasuhiko
    • Journal Title

      International Journal of Molecular Sciences

      Volume: 21 Pages: 6007-6007

    • DOI

      10.3390/ijms21176007

    • Related Report
      2020 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Xylosyl Extension of O-Glucose Glycans on the Extracellular Domain of NOTCH1 and NOTCH2 Regulates Notch Cell Surface Trafficking2020

    • Author(s)
      Urata Yusuke、Saiki Wataru、Tsukamoto Yohei、Sago Hiroaki、Hibi Hideharu、Okajima Tetsuya、Takeuchi Hideyuki
    • Journal Title

      Cells

      Volume: 9 Pages: 1220-1220

    • DOI

      10.3390/cells9051220

    • Related Report
      2020 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] N-Glycans on EGF domain-specific O-GlcNAc transferase (EOGT) facilitate EOGT maturation and peripheral endoplasmic reticulum localization2020

    • Author(s)
      Alam Sayad Md. Didarul、Tsukamoto Yohei、Ogawa Mitsutaka、Senoo Yuya、Ikeda Kazutaka、Tashima Yuko、Takeuchi Hideyuki、Okajima Tetsuya
    • Journal Title

      Journal of Biological Chemistry

      Volume: 295 Pages: 8560-8574

    • DOI

      10.1074/jbc.ra119.012280

    • Related Report
      2020 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Contribution of extracellular O-GlcNAc to the stability of folded epidermal growth factor-like domains and Notch1 trafficking2020

    • Author(s)
      Ogawa M, Tashima Y, Sakaguchi Y, Takeuchi H and Okajima T
    • Journal Title

      Biochem Biophys Res Commun.

      Volume: 526 Pages: 184-190

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2020.03.066

    • Related Report
      2019 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] POGLUT1 biallelic mutations cause myopathy with reduced satellite cells, alpha-dystroglycan hypoglycosylation and a distinctive radiological pattern.2020

    • Author(s)
      Servian-Morilla E, Takeuchi H, Paradas C et al.
    • Journal Title

      Acta Neuropathol

      Volume: 139 Pages: 565-582

    • DOI

      10.1007/s00401-019-02117-6

    • Related Report
      2019 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Effects of Notch glycosylation on health and diseases.2020

    • Author(s)
      Urata Y and Takeuchi H
    • Journal Title

      Dev Growth Differ

      Volume: 62 Pages: 35-48

    • DOI

      10.1111/dgd.12643

    • Related Report
      2019 Research-status Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Altered Notch signaling in Dowling-Degos disease: Additional mutations in POGLUT1 and further insights into disease pathogenesis.2019

    • Author(s)
      Ralser DJ, Takeuchi H, Betz RC et al.
    • Journal Title

      J Invest Dermatol

      Volume: 139 Pages: 960-964

    • DOI

      10.1016/j.jid.2018.10.030

    • Related Report
      2019 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Protein O-glucosylation: another essential role of glucose in biology2019

    • Author(s)
      Hongjun Yu and Hideyuki Takeuchi
    • Journal Title

      Curr Opin Struct Biol

      Volume: 56 Pages: 64-71

    • DOI

      10.1016/j.sbi.2018.12.001

    • Related Report
      2019 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Presentation] 細胞外 O-GlcNAc 修飾は EGF ドメインの安定性と Notch1 のトラフィッキングに寄与する2020

    • Author(s)
      小川光貴、田嶌優子、坂口大和、竹内英之、岡島徹也
    • Organizer
      第 93 回日本生化学会大会
    • Related Report
      2020 Research-status Report
  • [Presentation] 血液凝固第 XII 因子の活性化抑制における糖鎖修飾の役割2020

    • Author(s)
      中村澄香、小川光貴、竹内英之、岡島徹也、有森貴夫、高木淳一、相川京子
    • Organizer
      第 93 回日本生化学会大会
    • Related Report
      2020 Research-status Report
  • [Presentation] Significance of structurally diverse elongation of O-glucose glycans on Notch1 and Notch22019

    • Author(s)
      Takeuchi H, Urata Y, Tsukamoto Y, Saiki W, Senoo Y, Ma C, Wang WW, Aoki K, Tiemeyer M, and Okajima T
    • Organizer
      Annual Meeting of Society for Glycobiology
    • Related Report
      2019 Research-status Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] O-グルコース糖鎖修飾による Notch シグナルの調節機構2019

    • Author(s)
      竹内 英之
    • Organizer
      第 92 回日本生化学会大会
    • Related Report
      2019 Research-status Report
    • Invited
  • [Presentation] O-グルコース糖鎖修飾による衛星細胞における Notch シグナル制御の重要性2019

    • Author(s)
      竹内 英之
    • Organizer
      日本筋学会第 5 回学術集会
    • Related Report
      2019 Research-status Report
    • Invited
  • [Presentation] Significance of protein O-glucosylation for regulation of Notch signaling in satellite cells2019

    • Author(s)
      竹内 英之
    • Organizer
      第 7 回若手による骨格筋細胞研究会
    • Related Report
      2019 Research-status Report
    • Invited
  • [Book] 糖鎖生物学 生命現象と糖鎖情報2020

    • Author(s)
      北島健、佐藤ちひろ、門松健治、加藤晃一編
    • Total Pages
      295
    • Publisher
      名古屋大学出版会
    • ISBN
      9784815809812
    • Related Report
      2019 Research-status Report

URL: 

Published: 2019-07-04   Modified: 2021-12-27  

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