改変ヘルペスウイルスLAT発現系による恒久的治療遺伝子供給システムの構築
| Project/Area Number |
19K22505
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 47:Pharmaceutical sciences and related fields
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| Research Institution | Nippon Medical School |
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Principal Investigator |
宮川 世志幸 日本医科大学, 医学部, 講師 (90415604)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2022-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2020)
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| Budget Amount *help |
¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
Fiscal Year 2019: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
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| Keywords | ヘルペスウイルス / CRISPRa / インシュレーター / Herpes simplex virus / LAT |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、申請者らが近年開発した無毒化したヘルペスウイルス（HSV）ベクターシステムと改変ゲノム編集技術を組み合わせることにより、遺伝子治療において長い間課題点とされてきた治療遺伝子の不活性化の問題解決に挑む。申請者らは、無毒化HSVの特定のゲノム領域LATがインシュレーター配列により周辺のゲノム環境に影響を受けず、一定の転写活性を示すことを見出している。本領域に改変ゲノム編集技術を応用して同領域の転写活性を安定的に高い状態に保つことを実現する。以上により、長期的に治療遺伝子供給可能な新しい遺伝子治療戦略の提案を行う。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、無毒化ヘルペスウイルス（HSV）ベクターシステムに対して、半永久的に治療遺伝子が供給できる発現系を組み込み、次世代型の遺伝子治療ベクターの構築を達成する。今年度は、昨年度までに作製した改変CRISPR/Cas9発現系の評価を行い、本発現系に適するsgRNAを選定すること、開発した発現系を無毒化HSVベクターに組み込み、改変無毒化HSVベクターを作製することを目標としていた。本発現系は、ヌクレアーゼ活性を不活化したCas9 (dCas9)に転写活性因子を融合させた改変Cas9と治療遺伝子のモデルとしてAcGFPを2Aペプチドで連結した遺伝子発現系とtRNA発現機構を利用したsgRNA発現系から成る。同発現系に無毒化HSVベクターのHSV特異的インシュレーターLAT領域を標的としたsgRNAを組み込み、いずれのsgRNAが効率的に同領域を転写活性化できるか評価を試みた。転写活性化効率については、レポーター遺伝子を搭載した無毒化HSVベクターをtransductionした培養細胞に対して作製したdCas9ベクターを遺伝子導入することで検討した。その結果、当初のdCas9発現系のデザインでは効率的な転写活性上昇は認められないことがわかった。そこで本課題を解決するために、dCas9発現系とsgRNA発現系をそれぞれ独立したプラスミド上に再構築し、同様の試験を実施した。同試験により、作製したsgRNAのいくつかにおいてHSVの特定のゲノム領域の転写活性を有意に向上させる機能があることが判明した。現在、本発現系の発現カセットのデザインを最適化するために、sgRNA発現系の改変と挿入部位の検討を進めている。一方、並行して、同発現系の無毒化HSVベクターへの挿入も順次進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度は無毒化HSVベクターからの恒久的な遺伝子発現供給を実現するために、LAT領域を標的化するために最適なsgRNAの選定及び無毒化HSVベクターへの同発現系の挿入を予定していた。デザインしたsgRNAの発現系へのクローニングについては、滞りなく進行した。一方、sgRNAの機能評価については連結順序あるいは挿入部位の問題で同発現系の発現不良が確認され、評価に使用するsgRNA発現系の再構築を余儀なくされた。本課題は、dCas9発現系とsgRNA発現系を分離することで解決し、最終的には機能評価を完了し、HSV特異的インシュレーターLAT領域を標的化できるsgRNAの特定に至った。また同発現系を搭載した無毒化HSVベクターの作製については、当初計画した発現系の機能不全の問題対処及びコロナ禍の影響もあり、やや遅れが生じている。以上より、年度当初に計画した実験の多くは達成されたものの、全体の研究計画はやや遅れていると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の方針として、構築が終了した改変CRISPR/dCas9発現系及びsgRNA発現系を無毒化HSVベクターに組み込んだ組換えHSVベクターの開発を迅速に進める。同ベクターを用いて、実際に恒久的遺伝子発現が誘導可能かin vitro及びin vivo試験により確認する。
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Report
(2 results)
Research Products
(9 results)
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[Presentation] Efficacy and safety of non-cytotoxic herpes simplex virus-based vectors in vivo.2020
Author(s)
Yoshitaka Miyagawa, Motoyo Maruyama, Atsushi Sakai, Yuriko Sato, Seiji Kuroda, Hiromi Kinoh, Motoko Yamamoto, Ryotaro Hashizume, Hidenori Suzuki, Justus B. Cohen, Joseph C. Glorioso, Takashi Okada.
Organizer
The 43rd Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan (MBSJ2020)
Related Report
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[Presentation] Evaluation of Purification and Storage Conditions for Highly Defective, Non-Cytotoxic Herpes Simplex Virus Vectors for Gene Therapy.2020
Author(s)
Seiji Kuroda, Yoshitaka Miyagawa, Makoto Sukegawa, Taro Tomono, Motoko Yamamoto, Kumi Adachi, William F. Goins, Justus B. Cohen, Joseph C. Glorioso, and Takashi Okada.
Organizer
The 43rd Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan (MBSJ2020)
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[Presentation] Optimization of vector design of non-toxic herpes simplex virus-based vector for efficient in vivo transduction2019
Author(s)
Yoshitaka Miyagawa, Motoyo Maruyama, Seiji Kuroda, Atsushi Sakai, Yuriko Sato, Ryotaro Hashizume, Hiromi Kinoh, Motoko Yamamoto, Justus B. Cohen, Joseph C. Glorioso, Takashi Okada.
Organizer
The 43rd Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan (MBSJ2020)
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