RNA高次立体構造の生物学的意義の解明と疾患への応用
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19K22519
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 48:Biomedical structure and function and related fields
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| Research Institution | The University of Tokyo (2020)
Institute of Physical and Chemical Research (2019) |
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Principal Investigator |
有吉 哲郎 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 客員研究員 (00782103)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2022-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2020)
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| Budget Amount *help |
¥5,330,000 (Direct Cost: ¥4,100,000、Indirect Cost: ¥1,230,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2020: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
Fiscal Year 2019: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
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| Keywords | RNA / 蛍光イメージング / イメージング / グアニン四重鎖 / 遺伝子発現制御 |
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| Outline of Research at the Start |
ある種のRNAはグアニン四重鎖（G4）という特殊な構造を形成すること、G4の形成・解消がタンパク質による制御を受けることが知られている。G4の過剰な形成は脆弱X症候群、ALSなどの疾患に関与すると考えられているが、技術的限界からG4解消タンパク質の同定には至っていない。そこで本研究計画では、研究代表者が独自に開発した「G4形成依存的に光るRNA」を用い、G4解消タンパク質を網羅的に同定する。さらに同定されたG4解消タンパク質の標的遺伝子を決定し、G4を介した遺伝子発現制御機構を明らかにする。最後に、G4解消タンパク質を用いた疾患治療への応用を検討する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は薬剤添加依存的にRomanescoを発現させるES細胞及びiPS細胞株の樹立を行った。複数の安定発現株樹立法を比較し条件検討を行った結果、PiggyBacというトランスポゾンを用いた安定発現株樹立法がES, iPS細胞では最も効率が良いことを見出した。結果、ドキシサイクリンの添加依存的にRomanescoを発現させる株の樹立に成功した。
また、遺伝子発現抑制法の条件検討を行った。複数の遺伝子ノックアウト、ノックダウン法を比較検討した結果、レンチウイルスを用いてmiRNAを発現させることでノックダウンを実行する方法が最も効率が良いことを見出した。
加えて蛍光RNAイメージングに用いる顕微鏡法の比較検討を行った。STED, Airyscan, Spinning Disc共焦点顕微鏡法による蛍光RNAイメージングを比較した結果、AiryScanを用いた蛍光RNAイメージングが最も感度良く蛍光イメージング可能であることを見出した。
また、ES細胞やiPS細胞など多能性幹細胞におけるG4形成タンパク質の同定にトラブルが生じた場合に備え、その他の細胞種におけるスクリーニングの準備を進めた。具体的には、HEK293T細胞、DT40細胞においてRomanescoを安定発現する株の樹立を行った。さらにマウス初代培養神経細胞においてRomanescoを発現させる手法を検討し、アデノ随伴ウイルスを用いた発現が最も適していることを見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
当初の計画通り進展していることに加え、多能性幹細胞における安定発現株樹立の手法について新たな発見があったため
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度までに樹立した各手法を用いてG4形成に関与するタンパク質の同定を実行する
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Report
(2 results)
Research Products
(3 results)
