| Project/Area Number |
19K22540
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 49:Pathology, infection/immunology, and related fields
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
五條 理志 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (90316745)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
星野 温 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (50737210)
上 大介 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (80415588)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2021-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2019)
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| Budget Amount *help |
¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000)
Fiscal Year 2020: ¥3,120,000 (Direct Cost: ¥2,400,000、Indirect Cost: ¥720,000)
Fiscal Year 2019: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
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| Keywords | CAR T / 中和抗体 / ライソゾーム病 / Electroporation / mRNA |
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| Outline of Research at the Start |
ライソゾーム病の治療は、組換えタンパク質を用いた酵素補充療法が現れることによって、大きく前進した1。しかし、酵素が完全欠損に近い病態を有する患者においては、当該タンパク質が自己と認識されず、ERTの実施に伴い中和抗体が出現する2,3。本病態に対しては、現在のところ臨床応用されている抜本的な対策はない。本研究では、ライソゾーム病の代表疾患であるファブリー病をターゲットとして、酵素補充療法の際、男性患者の20－90％に及ぶ症例の体内に作られる組換えα-Galに対する抗体を産生するB細胞を、T細胞に組換え抗原を発現させる事で、排除するための新規治療法の開発を行う。
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| Outline of Annual Research Achievements |
当初の予定通り、細胞を用いてGLA酵素（alpha-galactosidase）とキメラレセプター（TM, CD28, 4-1BB, CD3zeta）結合させたBARキメラタンパク質を発現させたBAR細胞の作製を試みた。
このBARタンパク質配列を設計し、mRNAを合成した。このmRNAを細胞に導入し、細胞内での発現をウェスタンブロッティング法にて確認した。しかしながら、タンパク質発現は短期的には確認できたものの、長期間の発現維持が困難であった。mRNAの不安定性からこの結果になったと考え、BARキメラタンパク質を発現させるレトロウイルスベクターを再設計した。またGLAのシグナル配列（1-31aa）はBAR遺伝子に適していない可能性が高い。これはGLAがライソゾーム酵素のため、合成されたBARタンパク質が細胞内のライソゾームに局在している可能性があるためである。そこで新たにレトロウイルスベクターにGLA酵素の元来のシグナル配列（1-31）をCAR-Tで利用されているCD8由来のシグナル配列に置き換えることにした。
これとは別にBAR細胞のターゲットとなるGLA抗体を産生する細胞の樹立も試みた。このB細胞を模すため、レトロウイルスベクターにてscFV_GLAを恒常的に発現させる細胞を作製した。さらに細胞外にBARタンパク質の発現を確認するためにGLA抗体のscFVと蛍光タンパク質（mCherry）を融合させた遺伝子も設計した。このscFV_GLA-mCherryは細胞外に分泌されることはHEK293細胞を用いて確認できた。
以上のように本年はマテリアル作製を進めており、これらを用いて本系のvitroにおけるPOC確立を優先させ、その後、RNAを用いた系の構築を検討することにした。最終的にはこの系をvivoに適応させ、BARシステムの構築を完成させる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初のRNAでの適応はRNA分解が予想より早いため、細胞での実験が困難であった。そこでまずはレトロウイルスを用いてのPOCの確立を優先する。それとは別に合成RNAの安定化に必要な因子についても探索し、今後の実験に役立てていく。
現在は抗体発現細胞とBAR発現細胞の作製に必要なベクターは構築できたので、今後はBAR発現細胞を樹立する。
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| Strategy for Future Research Activity |
Vitroの研究成果をもとにVivoへの適応を進めていきたい。そのためにモデルとなる細胞は樹立を進めており、ターゲットとなる抗体発現細胞と、アタッカーとなる抗原発現細胞（BAR細胞）をそれぞれ樹立している。
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