PCSK9によるLDL受容体の細胞内輸送経路変更の分子機構

• Project/Area Number: 19K22632
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Medium-sized Section 54:Internal medicine of the bio-information integration and related fields
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 堀内 久徳 東北大学, 加齢医学研究所, 教授 (90291426)
• Project Period (FY): 2019-06-28 – 2021-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2019)
• Budget Amount: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000); Fiscal Year 2020: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2019: ¥5,200,000 (Direct Cost: ¥4,000,000、Indirect Cost: ¥1,200,000)
• Keywords: PCSK9 / 低比重リポ蛋白質受容体 / 家族性高コレステロール血症 / LDL受容体 / エンドソーム

Outline of Research at the Start

低比重リポ蛋白質LDLが結合した細胞膜上のLDL受容体（LDLR）はエンドソームに輸送され、そこで、LDLRとLDLは解離する。LDLRは形質膜にリサイクルされ、LDLはリソソームに運ばれ分解される。PCSK9が細胞外でLDLRに結合すると、LDLRがエンドソームから形質膜へリサイクルされず、リソソームへ運ばれ分解される。その結果、LDLR量が減少し、LDLの細胞内取り込み量が減少するため血清LDL値が上昇する。本研究ではこのPCSK9の作用機構を細胞内ナノボディライブラリー発現細胞を用いた発現クローニング法および、既知のLDLR受容体結合蛋白質の遺伝子KO細胞を用いた解析によって同定する。

Outline of Annual Research Achievements

低比重リポ蛋白質（LDL）の受容体（LDLR）の遺伝的欠損は家族性高コレステロール血症（FH）となる。LDLが結合した細胞膜上のLDLRはエンドソームに小胞輸送される。エンドソームでLDLRとLDLは解離し、LDLRは形質膜にリサイクルされ、LDLはリソソームに運ばれ分解される。Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 （PCSK9）が細胞外でLDLRに結合すると、LDLRがエンドソームから形質膜へリサイクルされず、リソソームへ運ばれ分解される。その結果、LDLR量が減少し、LDLの細胞内取り込み量が減少するため血清LDL値が上昇する。FHの約10％はPCSK9の変異が原因である。また、PCSK9阻害抗体が診療現場で用いられている。臨床的にも重要なPCSK9であるが、LDLR輸送をリサイクル経路からリソソーム経路に変更させる分子機構についてはほとんど不明である。本研究ではこのPCSK9の作用機構を分子レベルで解明することを目的し、以下を進めている。
（1）細胞内発現阻害抗体スクリーニングによる責任分子の同定：細胞内に免疫グロブリンライブラリーを発現させ、PCS9のLDLR減少作用をキャンセルする免役グロブリンを得て、責任因子を同定する計画である。免疫グロブリンライブラリーより特異抗体を得ることが出来、このライブラリーが非常に良くワークする確証を得た。現在、細胞内発現の条件を検討中である。
（2）LDLR結合蛋白質の解析：報告されているLDLR結合分子の中にはLDLRのリサイクルに重要ないくつかの分子も含まれている。ゲノム編集によりそれらの遺伝子欠損細胞を作製し、PCSK9のLDLRのリソソーム輸送に対する効果を解析する。減弱していればPCSK9の効果を担っている可能性がある。いくつかの候補分子の欠失細胞をほぼ完成させた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度、いくつかの進展があった。そのまま研究を進め、最終年度である2020年度に研究を完成させたいと考えている。

Strategy for Future Research Activity

免役グロブリンの発現条件を整え、細胞内発現阻害スクリーニングにって責任分子を同定する。また、LDL受容体結合蛋白質のKO細胞をさらに多く作成し、PCSK9機能を評価し、PCSK9の機能を担う責任分子を同定する。