Introduction of proteolytic enzyme into biomineralization process and its application to tooth enamel regeneration

Research Project

Project/Area Number	19K22717
Research Category	Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	Medium-sized Section 57:Oral science and related fields
Research Institution	Hiroshima University
Principal Investigator	谷本幸太郎広島大学, 医系科学研究科(歯), 教授 (20322240)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	國松亮広島大学, 病院(歯), 講師 (40580915) 加藤功一広島大学, 医系科学研究科(歯), 教授 (50283875) 廣瀬尚人広島大学, 医系科学研究科(歯), 助教 (50611935)
Project Period (FY)	2019-06-28 – 2021-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2019)
Budget Amount *help	¥5,980,000 (Direct Cost: ¥4,600,000、Indirect Cost: ¥1,380,000) Fiscal Year 2020: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000) Fiscal Year 2019: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000)
Keywords	バイオミネラリゼーション / エナメル質 / エナメル蛋白
Outline of Research at the Start	人体で最も硬い組織であるエナメル質の形成時には、エナメル芽細胞が産生する数種類のエナメル蛋白により、高度なハイドロキシアパタイト(HAP)結晶誘導制御（バイオミネラリゼーション）が行われる。本研究の目的は、歯の形成過程で出現する歯胚の内部環境を模倣することにより、エナメル質形成プロセスを再現し、これまで達成不可能であった臨床に応用できる十分なサイズのHAP結晶を生体内で構築する技術を開発することである。そのために、研究期間内に以下のことを明らかにする。１）ナノスフィア形成および分解反応液の至適条件２）バイオミネラリゼーションにおけるナノスフィア分解の効果３）生体内に適用した場合の有効性
Outline of Annual Research Achievements	平成３１年度では、ナノスフィア形成および分解反応液の至適条件の検討を行った。エナメル質形成機構の全貌は解明されていないが、アメロゲニンがミセル構造に集積したナノスフィアによりエナメル質の原型が作られ、その空間にカルシウムおよびリン酸イオンが集積することにより過飽和となってHAP結晶誘導が生じると考えられるため、ナノスフィアの形成とカルシウムおよびリン酸の濃度条件がきわめて重要となる。そこで、バイオミネラリゼーションプロトコール確立のため、反応溶液の至適条件の検討を行い、一定の条件を確立した。すなわち、完全長アメロゲニンを弱酸性条件で溶解したのち、中性までpHを上昇させることにより、凝集を誘導し、ナノスフィアを形成させる。その後のCaおよびPO4濃度条件を変えた検討では、それぞれの濃度の濃さおよび比率（Ca/P比）がRa値に変化を及ぼすことが明らかとなった。最もRa値の低下が得られたのは、2 mMのCaと2 mMのPO4（Ca/P比1.0）であった。Ca/P比1.0を維持した場合、他の濃度条件でも低いRa値が見られたが、Ca濃度がこれより高くても低くてもRa値が上昇する傾向が認められた。また、Ca濃度が高すぎるとRa値に有意な変化が生じなくなる。また、Ca濃度の限界値は、PO4濃度すなわち、Ca/P比によっても変動する。Ca/P比が1.0あるいは0.5であればCa濃度4 mM以上ではRa値は有意に変化しない。また、Ca/P比が0.25であればCa濃度2 mM以上ではRa値は有意に変化しない。さらに、Ca/P比が0.125になると、Ca濃度0.5 mM以上でRa値は有意に変化しなくなることが明らかとなった。本研究成果は、2019年９月１９日に東京で開催された広島大学新技術説明会にて「エナメル質再生法の開発とアメロゲニンペプチド創薬の探索」と題した発表を行った。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ハイドロキシアパタイト結晶誘導の条件検討を行い、一定の条件での結晶生成を確認できた。結晶の繰り返し成長の検討までは至っていないが、当初予定通り次年度の検討課題とする。
Strategy for Future Research Activity	2020年度では、計画通りバイオミネラリゼーションにおけるナノスフィア分解の効果を検討する。これまでナノスフィアによるHAP結晶誘導において、結晶生成は数百nmが限界であった。その原因と考えられる残留蛋白をMMP-20, KLK-4を用いて分解することにより、結晶誘導をさらに継続できるかどうかを実験1で求めた至適条件を用いて検証する。さらに、生体内に適用した場合の有効性の検討ビーグル犬による実験的カリエスモデルを用いてHAP結晶成長誘導サイクルによるエナメル質再生効果を検証する。in vitroで検証した方法が生体の口腔内環境においても再現できることを検証する。全身麻酔下で上顎切歯エナメル質表面にリン酸を用いた脱灰処理により擬似カリエス作製後、脱着可能なポリカーボネート製カバーによりバイオミネラリゼーション反応が可能な閉鎖環境を構築する。24時間後にカバーを外し、ナノスフィア分解処理を行った後、再び新たな反応液で24時間反応させる。本サイクルを複数回繰り返した後、歯を抜去し、HAP結晶生成をAFM で評価することとする。