Development of bioimaging technique for temperature measurement in skeletal muscle myofibers

Research Project

Project/Area Number	19K22800
Research Category	Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	Medium-sized Section 59:Sports sciences, physical education, health sciences, and related fields
Research Institution	The University of Electro-Communications
Principal Investigator	狩野豊電気通信大学, 大学院情報理工学研究科, 教授 (90293133)
Project Period (FY)	2019-06-28 – 2021-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2019)
Budget Amount *help	¥6,240,000 (Direct Cost: ¥4,800,000、Indirect Cost: ¥1,440,000) Fiscal Year 2020: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000) Fiscal Year 2019: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000)
Keywords	細胞内温度 / カルシウムイオン / 筋小胞体 / 骨格筋 / 筋収縮
Outline of Research at the Start	恒温動物のシステムは厳密にコントロールされた温度下において成立する．わずか1度の温度変動も生体においては大きな影響をもたらす．そのため生体内の温度をできるだけ精密に，素早く評価できる測定モデルの開発が望まれている．本研究は，生きたままの筋細胞の温度変化をリアルタイムに測定する方法の開発を，温度感受性蛍光プローブならびにフォトサーマル(光熱変換)イメージングという２つの異なるモデルからアプローチする．
Outline of Annual Research Achievements	細胞内の温度分布や変化を詳細に解析することは，細胞が示すさまざまな機能を解明することに結びつく．本研究は生きた小動物（マウス，ラット）の骨格筋を摘出することなく，生体内（in vivo）環境下で温度分布を画像化する技術の確立を目的としている．これまでに，我々のグループでは生きた動物個体の筋細胞内において変化するターゲット分子の挙動を画像化する方法（in vivoバイオイメージングモデル）構築し，骨格筋研究を展開してきた．このin vivoイメージング技術を基盤として，骨格筋細胞の温度変化を画像化するために，その１．複数の市販化された温度感受性蛍光プローブを利用する方法，ならびに，その２．フォトサーマル(光熱交換)原理を利用する方法によるin vivo細胞内温度評価モデルを構築することが研究目的である．令和元年度では，ラット骨格筋細胞に市販化されている温度感受性蛍光プローブ (Cellular Thermoprobe for Fluorescence Ratio) を導入し，骨格筋の収縮・弛緩による温度動態を調べた．その結果，筋細胞の熱動態をin vivoイメージングによって評価する実験モデルを構築することができた．この実験モデルによって，細胞質内のカルシウムイオン調節機構を担う細胞小器官である筋小胞体が，収縮弛緩サイクルの筋温変化に重要な役割を持つことが明らかにされた．
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本年度はin vivo環境下において，単一の骨格筋細胞に温度感受性蛍光色素をマイクロインジェクション法によって導入し，導入細胞における熱動態測定を行うことを目的とした．具体的には，1．ラットの骨格筋において蛍光温度プローブを用いた温度動態測定法を確立すること．2．その手法を用いて，骨格筋のカルシウムイオン調節機能に関わる熱産生動態をin vivo環境下で明らかにすることであった．蛍光温度プローブはCellular Thermoprobe for Fluorescence Ratio (funakoshi) を利用した．プローブ溶液を調整した溶液をガラスキャピラリに封入し，外科処置によって部分的に露出した脊柱僧帽筋の単一筋線維にマイクロインジェクション法により導入した．その結果，骨格筋内への単回のカルシウムイオンインジェクションによって，細胞内の温度は有意に上昇することが確認された．また，この時，カルシウムイオンインジェクション直後に筋収縮と弛緩サイクルを認めた．このプロトコールにおいて観察された温度上昇は，弛緩期でも持続して観察された．その一方，筋小胞体のカルシウムイオン取り込み（SR-Ca2+ ATPase: SERCA)を阻害剤（シクロピアゾン酸）の負荷によって抑制した場合，有意な温度低下がもたらされた．この結果は，カルシウムイオン調節機構の1つである筋小胞体によるカルシウムイオン取込ポンプを抑制すると，筋温が急激に低下すること示唆する．これらの結果は，筋収縮と弛緩サイクルを制御する筋小胞体が熱産生において主要な役割を担っていることを示唆している．
Strategy for Future Research Activity	上述したとおり，これまでの研究の成果として，市販化された蛍光温度プローブによって，in vivo環境下の単一筋細胞での温度変化ならびに，温度を制御するために筋小胞体のカルシウムイオン取り込みがキーとなっていることを解明した．今後は，異なる原理であるフォトサーマル（光熱交換）顕微鏡による温度評価を検討する．この観察方法は，レーザー光励起による生体内の熱の僅かな上昇（1/1000度以下）が起こす屈折率変化と検出光との相互作用から超解像の画像構築を可能とする技術である．近年，我々は，マウス骨格筋細胞のミトコンドリアを無標識の摘出筋組織を用いて観察することに成功した(Tomimatsu, Kano, Kobayashi et al. 2017, Biomedical Optics Express)．このシステムの最大の特徴は，ミトコンドリアを標識する蛍光物質や蛍光タンパク質の導入が不要なことである．つまり，細胞を前処理することなく直接レーザー光を照射することにより画像化できる技術である．本研究では，熱イメージングとして，励起光による熱発生（1/1000度以下）と検出光との差分を基準化し，細胞による熱発生を基準線からのズレとして検出することを試みる．前処理が不要であるメリットは非常に大きく，生きた細胞から温度情報を直接的に視覚化する技術の開発を試みる．