Fabrication of enzyme reaction fields in the brain for treatment of central nerve system disease

Research Project

Project/Area Number	19K22953
Research Category	Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	Medium-sized Section 90:Biomedical engineering and related fields
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	安楽泰孝東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 特任准教授 (60581585)
Project Period (FY)	2019-06-28 – 2021-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2019)
Budget Amount *help	¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000) Fiscal Year 2020: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000) Fiscal Year 2019: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
Keywords	酵素補充療法 / 血液脳関門 / 脳神経系疾患 / 脳 / 薬剤送達システム
Outline of Research at the Start	生体の恒常性は、酵素が精密制御された反応場を構築することで維持されており、とりわけ多くの神経回路が集積している脳においてその役割は極めて重要であり、機能欠損は脳神経系疾患の要因となる。そこで欠損した酵素を補充し、症状改善を計る酵素補充療法(ERT)が注目されておいるが、脳は血液脳関門(BBB)と呼ばれるバリアに守られているために、既存技術では酵素を効率的に送り届けることが困難である。そこで本研究課題では、我々がこれまでに確立してきた①BBBを効率的に通過する技術と、②ERTを効率的に惹起する薬物送達システムを組みわせ、脳内に酵素の反応場を構築し脳神経系疾患の治療へと展開することを目的とする。
Outline of Annual Research Achievements	生体の恒常性は、酵素が精密制御された反応場を構築することで維持されており、多くの神経回路が集積している脳においてその役割は極めて重要であり、機能欠損は脳神経系疾患の要因となる。欠損した酵素を補充し、症状改善を計る酵素補充療法が注目されており、疾患部位に『酵素の反応場』を創生する薬物送達システムは、副作用の低い革新的治療法として期待されている。我々が開発したPICベシクルは、酵素を失活することなく封入でき、PIC膜に特徴的な物質透過性を示すことから『酵素の反応場』として最適である。またグルコースを表層に搭載した高分子集合体を構築し、グルコーストランスポーター1を介し血糖値を精密制御することで臨床薬の約600倍を脳へ集積させる革新的な方法論を見出している。そこで本申請課題では、①PICベシクルに酵素を封入し、②表層にBBB通過用のリガンド分子を搭載することで、既存技術では不可能であった脳内に酵素の反応場を創出し、脳神経系疾患の革新的治療技術に展開することを目的とした。当該年度は、BBB通過型PICベシクルを形成する高分子合成及び酵素封入BBB通過型ベシクルの構築、及びその基礎物性評価を実施した。まず高分子として、PEGのα末端にグルコースを導入した荷電性ブロック共重合体を合成し、核磁気共鳴法、液体クロマトグラフィーを用いて構造を同定した。続いて酵素を封入したGluc-PICベシクルを調製し、動的光散乱測定、透過型電子顕微鏡観察により直径100 nmで単分散性の高いベシクル構造であることを確認した。蛍光標識した酵素を封入したPICベシクルを用いて、蛍光相関分光法により、1粒子あたり約4分子の酵素が封入されることを確認した。また前年度計画を前倒しして体内動態を評価したところ、標的とする脳内に酵素を送達できていることを確認した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 1: Research has progressed more than it was originally planned. Reason 高分子の分子設計からin vitroおよびex vivoでの機能評価、さらには疾患動物モデルにおける治療効果の確認へと展開される本研究計画において、下記の特筆すべき成果を得ることに成功した。 1) グルコースを表層に有するPICベシクルを構築するための高分子の合成、さらには直径100 nmで単分散なPICベシクルを調製することに成功した。 2) 1個のPICベシクルあたり酵素を4分子封入可能であり、さらにnaked酵素と比べて同等の酵素活性パラメタ(Km, Vmax)が得られている(封入の際に酵素活性に影響を与えていない)ことを確認した。 3) 当初の計画を前倒しして、動物実験を実施し、高い血中循環性(半減期18時間)と脳への集積(3%dose/g-brain)を確認することに成功した。
Strategy for Future Research Activity	これまでに酵素を封入したBBB通過型酵素封入PICベシクルの調製およびその基礎物性評価と体内動態評価を検討している。今後は、まず(1) BBB通過試験を実施する。前年度までに上記のBBB通過型酵素封入PICベシクルが、脳へ集積することを確認したが、BBB通過性についてin vivo共焦点顕微鏡を用いて評価する。続いて、(2) 脳内における酵素反応を評価する。ここではライゾソーム病(LSD)の治療酵素として知られるアリールサルファターゼA(ASA)を封入し、ASAと反応することで蛍光を発するプローブを脳室内投与し(蛍光基質はBBB通過能を有さないため)、プローブ由来の蛍光団が生成されることをin vivo共焦点顕微鏡で確認する。ここで、naked ASAを脳室内投与した群と比較し、BBB通過型PICベシクルを用いた群の優位性を明らかにする。最後に、(3) BBB通過型ASA封入PICベシクルを用いて、標的とするスルファチド量の減少をLC/MSおよび生化学自動分析装置を用いて定量することでLSDの治療効果を評価し、本システムが脳内において標的とする有害物質を分解する酵素補充療法の反応場として有用であることを実証する。