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A construction of new biosensor technology enabling highly sensitive detection of alpha-synuclein fibril originated from Parkinson's disease patient

Research Project

Project/Area Number 19K22964
Research Category

Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)

Allocation TypeMulti-year Fund
Review Section Medium-sized Section 90:Biomedical engineering and related fields
Research InstitutionKyoto Institute of Technology

Principal Investigator

野田 実  京都工芸繊維大学, 電気電子工学系, 教授 (20294168)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 山門 穂高  京都大学, 医学研究科, 特定准教授 (10378771)
島内 寿徳  岡山大学, 環境生命科学研究科, 准教授 (10335383)
寒川 雅之  新潟大学, 自然科学系, 准教授 (70403128)
Project Period (FY) 2019-06-28 – 2022-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2020)
Budget Amount *help
¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000)
Fiscal Year 2021: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
Fiscal Year 2020: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
Fiscal Year 2019: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
Keywordsパーキンソン病 / αシヌクレイン / リポソーム / 脂質膜 / カンチレバーセンサ / フィブリル / オリゴマー / モノマー / バイオセンサ / αーシヌクレイン / カンチレバー
Outline of Research at the Start

カンチレバーセンサ基本性能向上
1.バイオセンシング分子技術創成:aSyn検出感度向上、1)脂質膜種、2)糖鎖修飾、を検討。2.カンチレバー技術:応力集中構造パターンを考察し作製。3.改良カンチレバーセンサで低濃度aSyn線維化後の評価:低濃度(10-100 pM)のaSyn線維化後の検出性を評価、改良技術の効果、問題点を考察。
RT-QuIC 技術とカンチレバーセンサ技術の融合
1.モノマーから線維化の測定:通常RT-QuICで患者、健常者髄液サンプルの判別性検討。2.オリゴマー状態の改良カンチレバー測定:上記結果と比較して、カンチレバーとの融合での定性的な相異の導出、測定感度向上性を考察。

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、申請者が研究、開発してきたリポソーム固定化カンチレバーセンサ技術とRT-QuIC法という異常凝集タンパク質(aSyn)増幅技術を組み合わせて、aSyn凝集体の特異的かつ超高感度な検出の可能性を探索することを目的とする。臨床医学での現使用技術では感度自体、特に再現性の点で能力不足で実用レベル技術は現在無い。本年度は以下の進展が得られた。
まずaSynのカンチレバーセンサ検出原理面では、前年度確認された「aSyn微量フィブリルのモノマーへの自己鋳型化現象」に伴うと考えられる格段の高感度化の結果から、本年度は同結果の検証として、カンチレバー固定化リポソーム上での現象を可視認識すべく液中AFM観察を行い、センサ検出時濃度よりかなり高濃度化ではあるが同上でのaSynの凝集動態の一端を確認した。そして別センシング技術であるが測定原理が類似した力学センサであるQCMを用いて同現象を評価した結果、それらの濃度依存性、現象の経時特性が同一の傾向を有することを確認できた。
次に特異的検出感度向上を図るためにリポソーム表面糖脂質C16,C18修飾で検出感度増大が前年度確認されたが、タンパク質とリポソームの相互作用に対する糖脂質C16とC18の効果を検証した結果、それらの濃度依存性から母体の脂質との相分離が原因であると示唆された。
さらにデバイス技術では、チップ上のレイアウト性及び歩留まり改善のため、本年度高感度を維持しつつカンチレバー構造体のサイズ縮小を図った。歪検知用NiCr薄膜の作製条件の再検討と応力集中により、カンチレバー長が1/3程度でも以前の10倍以上の感度を確保できることを実証した。
そして今後本技術との比較する上で具体的データベースとなる従来手法のELISA、RT-QuICによるパーキンソン病患者等の生体サンプルでの評価系を構成した。それら評価データの収集を進めている。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

前年度「aSyn微量フィブリルのモノマーへの自己鋳型化現象」に伴うと考えるカンチレバーセンサ上での格段の感度向上が確認されたため、カンチレバー上での同現象を可視化すべく液中AFM観察を行い、センサ検出時濃度よりかなり高濃度化であるが同上でのaSynの凝集動態の一端を確認した。そして別センシング技術であるが測定原理が類似した力学センサであるQCMを用い、同現象を評価した結果、濃度依存性、現象の経時特性の観点で同一の傾向を確認できた。現報告時点では使用したQCMよりも作製・使用中のカンチレバーセンサが1桁程度高感度であった。
前年度糖脂質C16, C18修飾で検出感度増大を確認し、糖脂質の相分離を示唆したが、さらにタンパク質とリポソームとの相互作用に対する脂質C16, C18の濃度依存性を検討した結果、単調増加ではなく、一定の濃度で相互作用の強度が大きく増大した。これは母体の脂質との相分離が原因であることをさらに示唆した。
カンチレバーの感度改善では、前年度同構造体の応力を集中させることで20倍の感度向上を達成したが、同面積が大きくなり、センサチップ上レイアウト自由度や作製歩留まりの面で課題があった。そこで感度のカンチレバーサイズ依存性を理論面、実験面双方から検討した結果、その長さを単に短くすると感度は低下するが、従来と同程度(昨年度の1/3程度の長さ)のサイズであっても、新設計のカンチレバーでは10倍以上の感度が確保できた。また歪ゲージに用いるNiCr薄膜成膜時の基板温度の高温化で感度向上することを確認した。
そして今後根拠とする生体サンプル中の超微量aSyn凝集体を測定するための系として、ELISAとRT-QuICの系を確立した。PBSバッファー中の精製aSyn凝集体の測定においては、ELISAにおいてはpg/mlオーダーのaSyn oligomerが検出可能であった。

Strategy for Future Research Activity

本年度の進捗にて、本研究の主要目的であるaSyn凝集体の超高感度検出の技術的実現性がより具体化されてきた。前年度「aSyn微量フィブリルのモノマーへの自己鋳型化現象」をカンチレバーセンサ上で良好に発現できたと考えられたが、液中AFMでの可視的なaSynフィブリルの凝集動態の一端を確認、そして別センシング技術のQCMにて同等のaSyn濃度依存性、経時特性を再確認できた。前年度からの開発中の新技術である糖脂質C16,C18修飾では、さらにその濃度依存性からある一定濃度が必要で母体脂質からの相分離現象が明らかとなり、確認されていた検出高感度化の原因が具体的になってきた。また同じく開発中新技術であるカンチレバーセンサデバイス技術として歪ゲージNiCr薄膜では、発生ノイズ低減のために製膜温度の最適化が有用であるとともに、微量窒素や酸素の添加も有用である可能性が見えてきた。
今後最終年度に向けて、効果が検証されたaSynの自己鋳型化現象を発現させるバイオプロトコルと、開発する新技術である糖脂質C16,C18修飾と歪ゲージNiCr薄膜の製膜プロセス技術の融合により、aSyn極微量フィブリルの特異的検出を具体的に実現していく。
一方、データベース構築、蓄積の点で、臨床医学側からのパーキンソン病患者、患者予備軍の方々から生体液、主に髄液を測定、評価中である。上記ELISAとRT-QuICの系は精製凝集aSynに対して有効であったが、生体サンプル中には抗原抗体反応・RT-QuIC反応を阻害する様々な物質が存在するため、抗凝集aSyn抗体を用いた精製過程を挿入し、感度・特異度の向上を目指す。これら従来技術の具体的な能力、問題点をさらに明白にしていく。
以上、今後の実験、評価結果を基に、挑戦的研究(萌芽)の本質的な成果の獲得として進めていく。

Report

(2 results)
  • 2020 Research-status Report
  • 2019 Research-status Report

Research Products

(25 results)

All 2021 2020 2019 Other

All Journal Article (7 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Peer Reviewed: 7 results,  Open Access: 4 results) Presentation (16 results) (of which Int'l Joint Research: 5 results) Remarks (1 results) Patent(Industrial Property Rights) (1 results)

  • [Journal Article] Perampanel Inhibits α-Synuclein Transmission in Parkinson's Disease Models2021

    • Author(s)
      Ueda J, Uemura N, Sawamura M, Taguchi T, Ikuno M, Kaji S, Taruno Y, Matsuzawa S, Yamakado H, Takahashi R.
    • Journal Title

      Mov Disord. 2021 Apr 4. doi: 10.1002/mds.28558. Epub ahead of print. PMID: 33813737

      Volume: 4 Pages: 28558-28558

    • DOI

      10.1002/mds.28558

    • NAID

      120007030224

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    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] α-Synuclein Spread from Olfactory Bulb Causes Hyposmia, Anxiety, and Memory Loss in BAC-SNCA Mice2021

    • Author(s)
      Uemura N, Ueda J, Yoshihara T, Ikuno M, Uemura MT, Yamakado H, Asano M, Trojanowski JQ, Takahashi R
    • Journal Title

      Mov Disord. 2021 Feb 6. doi: 10.1002/mds.28512. Epub ahead of print. PMID: 33547846

      Volume: 2 Pages: 28512-28512

    • DOI

      10.1002/mds.28512

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    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Mice with a cleavage-resistant N-cadherin exhibit synapse anomaly in the hippocampus and outperformance in spatial memory tasks2021

    • Author(s)
      M. Asada-Utsugi, K. Uemura, M. Kubota, Y. Noda, Y. Tashiro, T. M. Uemura, H. Yamakado, M. Urushitani, R. Takahashi, S. Hattori, T. Miyakawa, N. Ageta-Ishihara, K. Kobayashi, M. Kinoshita, A. Kinoshita
    • Journal Title

      Molecular Brain

      Volume: 14 Issue: 1 Pages: 1-16

    • DOI

      10.1186/s13041-021-00738-1

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    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Label‐free, chronological and selective detection of aggregation and fibrillization of amyloid β protein in serum by microcantilever sensor immobilizing cholesterol‐incorporated liposome2020

    • Author(s)
      Tomoya Taniguchi, Toshinori Shimanouchi, Masayuki Sohgawa, Minoru Noda
    • Journal Title

      Biotechnology and Bioengineering , Volume117, Issue8, 2469-2478, (2020)

      Volume: Volume117, Issue8 Pages: 2469-2478

    • DOI

      10.1002/bit.27380

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    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Developmental Changes in Dendritic Spine Morphology in the Striatum and Their Alteration in an A53T α-Synuclein Transgenic Mouse Model of Parkinson’s Disease2020

    • Author(s)
      Parajuli Laxmi Kumar、Wako Ken、Maruo Suiki、Kakuta Soichiro、Taguchi Tomoyuki、Ikuno Masashi、Yamakado Hodaka、Takahashi Ryosuke、Koike Masato
    • Journal Title

      eNeuro. 2020 Aug 27;7(4):ENEURO.0072-20.2020. doi: 10.1523/ENEURO.0072-20.2020. PMID: 32817196; PMCID: PMC7470930

      Volume: 7 Pages: 0072-20

    • DOI

      10.1523/eneuro.0072-20.2020

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    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] BCAS1-positive immature oligodendrocytes are affected by the α-synuclein-induced pathology of multiple system atrophy2020

    • Author(s)
      Kaji S, Maki T, Ueda J, Ishimoto T, Inoue Y, Yasuda K, Sawamura M, Hikawa R, Ayaki T, Yamakado H, Takahashi R
    • Journal Title

      Acta Neuropathologica Communications

      Volume: 8 Pages: 120-120

    • DOI

      10.1186/s40478-020-00997-4

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    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Susceptibility to erastin- induced ferroptosis decreases during maturation in a human oligodendrocyte cell line2020

    • Author(s)
      Hoshino T, Yamakado H, Takahashi R, Matsuzawa SI
    • Journal Title

      FEBS Open Bio. 2020 Sep;10(9):1758-1764. doi: 10.1002/2211-5463.12923. Epub 2020 Jul 30. PMID: 32608563; PMCID: PMC7459400

      Volume: 10 Pages: 1758-1764

    • DOI

      10.1002/2211-5463.12923

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      2020 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] リポソームセンシングにおけるNaCl添加によるパーキンソン病原因物質αシヌクレイン凝集体検出感度向上2021

    • Author(s)
      紙谷 虎太郎, 小林 亮子, 澤村 正典, 山門 穂高, 野田 実
    • Organizer
      16p-Z21-7. 第68回応用物理学会春季学術講演会. オンライン開催. 3月16-19日 (2021) 11-126.
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  • [Presentation] AN ULTRASENSITIVE DETECTION OF AGGREGATED α-SYNUCLEIN AS A BIOMARKER MOLECULE FOR PARKINSON DISEASE BY LIPOSOME-IMMOBILIZED CANTILEVER BIOSENSOR USING SELF-TEMPLATING PHENOMENA OF PRIONOID PROTEINA2020

    • Author(s)
      Ryoko Kobayashi, Masanori Sawamura, Hodaka Yamakado, Masayuki Sohgawa, Minoru Noda
    • Organizer
      C3L-A-2, MicroTAS 2020, Online Conference, October. 4-9 (2020) 1274.
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    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] A Novel Detection Method of Biomarker Molecule of α-Synuclein for Parkinson Disease by Liposome-Immobilized Cantilever Biosensor Using Self-Templating Phenomena of Prionoid Protein2020

    • Author(s)
      Ryoko Kobayashi, Masanori Sawamura, Hodaka Yamakado, Masayuki Sohgawa, Minoru Noda
    • Organizer
      G-8-03, The 2020 International Conference on Solid State Devices and Materials (SSDM2020), Virtual Conference, Septmber. 27-30 (2020) 463-464.
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    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] リポソーム固定化カンチレバーセンサを用いたパーキンソン病原因物質αシヌクレイン凝集体の超高感度検出2020

    • Author(s)
      小林亮子, 澤村正典, 山門穂高, 寒川雅之, 野田実
    • Organizer
      28A3-SS3-6, 第37回「センサ・マイクロマシンと応用システム」シンポジウム, オンライン開催, 10月26-28日 (2020)
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  • [Presentation] リン脂質リポソーム固定化カンチレバーセンサを用いたパーキンソン病患者血清中αシヌクレインの検出2020

    • Author(s)
      小林 亮子, 澤村 正典, 山門 穂高, 寒川 雅之, 野田 実
    • Organizer
      9a-Z12-2, 第81回応用物理学会秋季学術講演会, オンライン開催, 9月8日-11日 (2020) 11-075.
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  • [Presentation] Au電極上固定化リポソーム表面でのαシヌクレインの凝集・線維化の液中AFM観察2020

    • Author(s)
      小林 亮子, 澤村 正典, 山門 穂高, 野田 実
    • Organizer
      11a-Z12-1, 第81回応用物理学会秋季学術講演会, オンライン開催, 9月8-11日 (2020) 11-225.
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  • [Presentation] 早期パーキンソン病のモデルの開発と治療の可能性2020

    • Author(s)
      山門穂高
    • Organizer
      第38回日本神経治療学会学術集会(シンポジウム) 2020年10月30日
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  • [Presentation] Animal model for disease-modifying therapies in Parkinson's disease2020

    • Author(s)
      山門穂高
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      第61回 日本神経学会学術大会 (シンポジウム) 2020年9月1日
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  • [Presentation] 高ゲージ率Cr-N薄膜及び設計改良によるMEMS触覚センサの感度向上2020

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      金田 蓮, 安部 隆, 丹羽 英二, 寒川雅之
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      令和2年度電気学会A部門大会 2020年度
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      金田蓮, 安部隆, 寒川雅之
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      小林 亮子、澤村 正典、山門 穂高、寒川 雅之、野田 実
    • Organizer
      12a-A408-5, 第67回応用物理学会秋季学術講演会, 上智大学 四谷キャンパス 東京, 3月12日-15日 (2020).
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      小林 亮子、澤村 正典、山門 穂高、寒川 雅之、野田 実
    • Organizer
      12a-A408-6, 第67回応用物理学会秋季学術講演会, 上智大学 四谷キャンパス 東京, 3月12日-15日 (2020).
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    • Author(s)
      R. Kobayashi, M. Sawamura, H. Yamakado, M. Sohgawa, M. Noda
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      PP-8, 2019 International Meeting for Future of Electron Devices, Kansai (IMFEDK 2019), Kyoto, Japan, November. 14-15 (2019)
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  • [Presentation] A Novel Detection of Biomarker Molecule of αsynuclein for Parkinson Disease by Phospholipid Liposome-Immobilized Cantilever Biosensor Using Real-Time Quaking-Induced Conversion Method2019

    • Author(s)
      R. Kobayashi, M. Sawamura, H. Yamakado, M. Sohgawa, M. Noda
    • Organizer
      C3L-A-2, IEEE Sensors 2019, Montreal, Canada, October. 27-30 (2019) 1274.
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  • [Presentation] A NEW DETECTION OF BIOMARKER MOLECULE OF ALPHA-SYNUCLEIN FOR PARKINSON DISEASE BY PHOSPHOLIPID LIPOSOME-IMMOBILIZED CANTILEVER MICROSENSOR WITH TEMPERATURE STABILIZATION2019

    • Author(s)
      R. Kobayashi, M. Sawamura, H. Yamakado, M. Sohgawa, M. Noda
    • Organizer
      T3P.011, Transducers 2019, Berlin, Germany, June. 23-27 (2019)
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    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] RT-QuIC法を用いたリポソーム固定化カンチレバーセンサによるαシヌクレインの検出2019

    • Author(s)
      小林 亮子, 澤村 正典, 山門 穂高, 寒川 雅之, 山下 馨, 野田 実
    • Organizer
      19a-E203-1, 第80回応用物理学会秋季学術講演会, 北海道大学 札幌キャンパス 北海道, 9月18日-21日 (2019).
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  • [Remarks] 京都工芸繊維大学 大学院工芸科学研究科 電子システム工学専攻 電子デバイス工学研究室 研究業績リスト

    • URL

      http://www.cis.kit.ac.jp/~led/worklist/worklist_index.html

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  • [Patent(Industrial Property Rights)] 神経変性疾患におけるバイオマーカー分子の検出方法2019

    • Inventor(s)
      野田 実、山門穂高、澤村正典、高橋良輔
    • Industrial Property Rights Holder
      京都工芸繊維大学、京都大学
    • Industrial Property Rights Type
      特許
    • Industrial Property Number
      2019-160220
    • Filing Date
      2019
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URL: 

Published: 2019-07-04   Modified: 2021-12-27  

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