Development of non-viral vector to realize treatment of hereditary disease using genome editing RNA technology
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19K22972
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 90:Biomedical engineering and related fields
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| Research Institution | Daiichi University, College of Pharmaceutical Sciences |
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Principal Investigator |
有馬 英俊 第一薬科大学, 薬学部, 教授 (50260964)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
城野 博史 熊本大学, 病院, 准教授 (40515483)
北岸 宏亮 同志社大学, 理工学部, 教授 (60448090)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2022-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2019)
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| Budget Amount *help |
¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000)
Fiscal Year 2021: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
Fiscal Year 2020: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
Fiscal Year 2019: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
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| Keywords | ゲノム編集 / 家族性アミロイドポリニューロパチー / CRISPR mRNA / ガイドRNA / 肝臓特異的非ウイルスベクター / シクロデキストリン / PAMAMデンドリマー / 結合体 / 遺伝性難病 / CRISPRA Cas9 mRNA |
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| Outline of Research at the Start |
ゲノム編集技術は遺伝性疾患の根治療法を実現可能な次世代治療システムである。本研究では、肝臓の遺伝子疾患であるFAPに対するゲノム編集用CRISPR Cas9 mRNAおよびガイドRNAならびに申請者が開発した肝実質細胞特異的核酸キャリア（Lac-PaC）との３元複合体を用いて、FAPに対する新規治療システムの開発を目指す。方法として、CRISPR mRNA/ガイドRNA/Lac-PaCとの３元複合体を調製し、その有効性・安全性をin vitroおよびin vivoにて評価する。本研究が成功した暁には究極のFAP治療薬の誕生につながるだけなく、様々な肝臓の遺伝性疾患への応用が期待される。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、肝臓の遺伝子疾患である家族性アミロイドポリニューロパチー（FAP）に対する根治療法としてのin vivoゲノム編集技術の開発を目的に、(1) 肝実質細胞特異的非ウイルスベクターであるデンドリマー/シクロデキストリン結合体（CDE）にラクトースまたはN-アセチルガラクトサミンおよびポリエチレングリコ―ル（PEG）を結合したそれぞれL-PaCおよびGN-PaCの構築、(2) ゲノム編集効率の向上を企図して、核内での遺伝子発現が不要なCRISPR mRNA及びガイドRNAの構築、(3) L-PaCまたはGN-PaCとCRISPR mRNA及びガイドRNAと複合体形成及びそれらの物理化学的性質の評価、(4) ヒト肝実質培養細胞（HepG2細胞）でのゲノム編集効率に関する基礎的検討を行うことを計画した。2019年度は、研究代表者の所属変更に伴う研究環境の大きな変化並びに新型コロナウイルス感染拡大に伴う研究制限等により、計画した研究を十分に遂行できなかった。このような状況から、予算消費も予定額より少なくなった。実際には、ゲノム編集用mRNAの調製の予備的検討として、レポーター遺伝子であるルシフェラーゼmRNAの調製を行った。また、肝実質細胞特異的非ウイルスベクターとして、ラクトース及びPEG修飾PAMAMデンドリマー（G4）の調製を試みた。2019年8月29日～9月1日に中国の成都市で開催された第10回アジアシクロデキストリンシンポジウムにて研究内容の一部を発表した。2020年度は、新型コロナウイルス感染拡大状況に依存するところもあるが、可能な限り研究の遅れを少しでも取り戻すべく尽力したい。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
本研究では、肝臓の遺伝子疾患である家族性アミロイドポリニューロパチー（FAP）に対する根治療法としてのin vivoゲノム編集技術の開発を目的に、2019年度は以下に示す研究を計画した。(1) 肝実質細胞特異的非ウイルスベクターであるデンドリマー/シクロデキストリン結合体（CDE）にラクトースまたはN-アセチルガラクトサミンおよびポリエチレングリコ―ル（PEG）を結合したそれぞれL-PaC及びGN-PaC の構築、(2) ゲノム編集効率の向上を企図して、核内での遺伝子発現が不要なCRISPR mRNA及びガイドRNAの構築、(3) L-PaCとGN-PaCとCRISPR mRNA及びガイドRNAと複合体形成並びにそれらの物理化学的性質の評価、(4) ヒト肝実質培養細胞（HepG2細胞, ASGPR(+)）でのゲノム編集効率に関する基礎的検討を行う。2019年度は、研究代表者の所属機関の変更に伴う研究環境の大きな変化並びに新型コロナウイルス感染拡大に伴う研究制限等により、計画した研究を十分に遂行できなかったが、研究環境の整備を実施するとともに、ゲノム編集用mRNA及びレポーター遺伝子であるルシフェラーゼmRNAの調製、細胞導入実験、mRNAの細胞導入実験、肝実質細胞特異的非ウイルスベクターとして、ラクトース及びPEG修飾PAMAMデンドリマー（G4）の調製を試みた。なお、2019年8月29日～9月1日に中国の成都市で開催された第10回アジアシクロデキストリンシンポジウムにおいて研究内容の一部を発表した。
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| Strategy for Future Research Activity |
2019年度の研究進捗状況を踏まえて、2020年度は次のような研究を行う予定である。L-PaCとGN-PaCの構造解析および各リガンドの最適化、(2) CRISPR mRNA及びガイドRNAの構築、(3) L-PaC及びGN-PaCとCRISPR mRNA及びガイドRNAと複合体形成並びにそれらの物理化学的性質の評価、(4) ヒト肝実質培養細胞（HepG2細胞, ASGPR(+)）でのゲノム編集効率に関する基礎的検討を行う。また、新型コロナウイルス感染拡大の状況によるが、できれば上記の課題 (1)-(4) で見出したCRISPR mRNA/ガイドRNA/L-PaC複合体または同GN-PaC複合体から成る３元複合体を用いて、HepG2 細胞におけるゲノム編集効果に関する検討および細胞障害性に関する検討を行う。 また、マウスを用いて、CRISPR mRNAおよびガイドRNAの体内動態、ゲノム編集に関するオンターゲット効果およびオフターゲット効果、薬効（遺伝子発現、病態改善）および安全性に関する検討を行いたい。すなわち、CRISPR mRNA/ガイドRNA/L-PaC複合体または同GN-PaC複合体を静脈内投与後の肝臓におけるTTR mRNA発現をqPCRにより、また血中のTTRタンパク質量をELISAにより定量したい。TTRのアミロイド繊維形成については、腸管組織の切片を作成し、免疫組織染色により検討する。ゲノム編集については、標的臓器である肝実質細胞および標的以外の肺、肝臓、膵臓、腎臓、心臓、小腸などにおけるゲノムを次世代シークエンサー等を用いて評価したい。
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Report
(1 results)
Research Products
(3 results)
