Development of non-viral vector to realize treatment of hereditary disease using genome editing RNA technology
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19K22972
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 90:Biomedical engineering and related fields
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| Research Institution | Daiichi University, College of Pharmaceutical Sciences |
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Principal Investigator |
有馬 英俊 第一薬科大学, 薬学部, 教授 (50260964)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
城野 博史 熊本大学, 病院, 准教授 (40515483)
北岸 宏亮 同志社大学, 理工学部, 教授 (60448090)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2022-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2020)
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| Budget Amount *help |
¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000)
Fiscal Year 2021: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
Fiscal Year 2020: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
Fiscal Year 2019: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
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| Keywords | ゲノム編集 / 家族性アミロイドポリニューロパチー / CRISPR mRNA / ガイドRNA / 肝臓特異的非ウイルスベクター / シクロデキストリン / PAMAMデンドリマー / 結合体 / 遺伝性難病 / CRISPRA Cas9 mRNA |
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| Outline of Research at the Start |
ゲノム編集技術は遺伝性疾患の根治療法を実現可能な次世代治療システムである。本研究では、肝臓の遺伝子疾患であるFAPに対するゲノム編集用CRISPR Cas9 mRNAおよびガイドRNAならびに申請者が開発した肝実質細胞特異的核酸キャリア（Lac-PaC）との３元複合体を用いて、FAPに対する新規治療システムの開発を目指す。方法として、CRISPR mRNA/ガイドRNA/Lac-PaCとの３元複合体を調製し、その有効性・安全性をin vitroおよびin vivoにて評価する。本研究が成功した暁には究極のFAP治療薬の誕生につながるだけなく、様々な肝臓の遺伝性疾患への応用が期待される。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、ウイルスベクターを用いた研究例が多い中、申請者らが開発した非ウイルスベクターであるポリアミドアミン（PAMAM）デンドリマー/シクロデキストリン結合体に肝実質細胞膜上の発現しているアシアロ糖タンパク質受容体に対するリガンドを結合したGN-PaCを調製し、ゲノム編集用RNAであるCRISPR mRNAとガイドRNAとの３元複合体を用いて、肝臓の難治性疾患であるトランスサイレチン（TTR）型家族性アミロイドポリニューロパチー（TTR-FAP）に対するゲノム編集に基づく根治治療に関する検討を行っている。2020年度は、次のような検討を実施した。PAMAMデンドリマー(G4）に肝実質細胞ターゲティングリガンド及びβ-シクロデキストリンを結合したGN-CDE（G4）の合成を行い、そのリガンド分子数及びβ-シクロデキストリン分子数などの構造解析を行った。また、GN-CDEの培養細胞へのmRNA導入能を明らかにするため、レポーター遺伝子であるルシフェラーゼmRNAとPAMAMデンドリマー(G4)またはGN-CDE（G4）との複合体形成を電気泳動にて確認するとともに、それらの物理化学的性質について検討を行った。さらに、そのmRNA複合体をヒト肝実質培養細胞であるHepG2細胞に導入し、ルシフェラーゼ遺伝子の発現と細胞障害性について検討を行った。加えて、TTRに対するCRISPR TTR mRNAおよびガイドRNAの構築に関しても検討を行っている。研究業績に関しては、研究発表の場としての国際学会の機会はすべて失われ、国内での学会発表の機会も得られなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
2020年度も新型コロナウイルス感染拡大防止の観点から、研究室の利用が大きく制限されたことなどが影響し、研究の進捗は遅れる結果となった。当初、2019年度に（１）CRISPR TTR mRNA及びガイドRNAの構築、（２）肝実質細胞特異的mRNAキャリアとしてのGN-PaCの開発、（３）これら複合体の調製と物理化学的性質の評価、（４）ヒト肝実質培養細胞（HepG2細胞）でのゲノム編集効率に関する基礎的検討を行う予定であったが、（２）、（３）及び（４）についての検討は実施できたが、構造の最適化やデータの十分な検証を実施するに至らなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度は、本課題研究の最終年に当たることから、これまでの研究の進捗の遅れを踏まえて、次の検討を行う予定である。（１）CRISPR TTR mRNA/ガイドRNA/GN-PaCから成る３元複合体を用いて、HepG2細胞におけるゲノム編集効率・細胞障害性に関する検討、（２）健常マウス及びFAP トランスジェニックモデルマウスにおけるCRISPR mRNAおよびガイドRNAの体内動態、ゲノム編集に関するオンターゲット効果およびオフターゲット効果、薬効（遺伝子発現、病態改善）および安全性に関する検討などである。これらの検討を行うことにより、当初の研究目標である申請者らが開発した肝実質細胞特異的非ウイルスベクターを用いた肝臓の遺伝子疾患（難病）であるTTR-FAPに対する根治療法としてのin vivoゲノム編集技術の開発を進めたい。
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Report
(2 results)
Research Products
(3 results)
