Endothelium function under limb ischemia condition of aging mouse model

• Project/Area Number: 19K23829
• Research Category: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: 0802:Biomedical structure and function and related fields
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 川久保 英介 九州大学, 医学研究院, 共同研究員 (50644754)
• Project Period (FY): 2019-08-30 – 2021-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2019)
• Budget Amount: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000); Fiscal Year 2020: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2019: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: 加齢 / BubR1 / eNOS / 下肢虚血 / 老化

Outline of Research at the Start

当科にて育成中のBubR1野生型マウス(BubR1+/+)とBubR1低発現マウス(BubR1L/L)を用いて下肢虚血モデルマウスを作成する。この下肢虚血モデルマウスについて、虚血術前、術後1, 4, 7, 10日目に採血を行いcGMPを測定しNO産生能として評価する。また虚血術前、術後1, 4, 7, 10日にてマウスを頸椎脱臼にて安楽死させ、左側の腓腹筋および胸腺を採取する。各々からタンパク抽出し、Pl3K, Akt, p-AKt, eNOS, p-eNOS, BubR1およびp38, p-p38の発現量をウエスタンブロットで評価する。

Outline of Annual Research Achievements

当科では、加齢に関与する因子の一つとして細胞周期遺伝子BubB1に注目して、これまでBubR1発現低下が下肢虚血に対する血管新生を抑制すること、細胞モデル・動物モデルでBubR1発現低下がeNOSの発現を抑制することを報告してきた。BubR1低発現マウスにおける下肢虚血モデルでは血管新生が抑制されVEGF発現も抑制されていたが、一方でBubR1発現抑制によってeNOS発現は低下するもののVEGFとの関連は明確化されていない。今回我々は、下肢虚血モデルマウスを用いてBubR1が血管内皮機能の低下に関与していることを明確化を試みている。
本研究ではBubR1野生型マウス(BubR1+/+)とBubR1低発現マウス(BubR1L/L)を用いるが、まず予備実験として市販のマウスを用いて下肢虚血モデルマウス作成の手技確立を行った。具体的には3種混合麻酔(メデトミジン＋ミダゾラム＋ブトルファノール)下に、左下肢の総大腿動脈から内・外伏在動脈までを、伴走静脈と共に除去した。この下肢虚血モデルマウスの虚血下肢の筋肉・血管におけるBubR1の発限量およびeNOS発現・活性およびNO産生能を評価・検討する目的で、虚血術前、術後1, 4, 7, 10日目に採血を行った。また虚血術前、術後1, 4, 7, 10日にてマウスを頸椎脱臼にて安楽死させ、左側の腓腹筋および胸腺を採取し、各々からタンパク抽出した。
血液検体は、ELISAによりcGMPを測定しNO産生能として評価した。また筋・胸腺から抽出したタンパクを用いて、ウエスタンブロットによりPl3K, Akt, p-AKt, eNOS, p-eNOS, BubR1およびp38, p-p38の発現量の評価を試みた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

下肢虚血肢モデルマウス構築に際して術死や急性下肢虚血に至ることのない手術手技の構築に時間を要した。また、本試験に臨むにあたり、BubR1低発現マウスを必要個体数まで繁殖させることに時間を要している。

Strategy for Future Research Activity

引き続きBubR1低発現マウスの繁殖と並行して下肢虚血モデルマウスの作成および標本(血液・組織タンパク)採取を継続し手技を確立する。