| Project/Area Number |
19K23943
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
0902:General internal medicine and related fields
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
赤嶺 祥真 大阪大学, キャンパスライフ健康支援センター, 特任助教(常勤) (00846222)
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| Project Period (FY) |
2019-08-30 – 2021-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2019)
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| Budget Amount *help |
¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2019: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | 細胞外小胞 / バイオマーカー / 神経細胞 / 認知症 / エクソソーム / リキッドバイオプシー |
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| Outline of Research at the Start |
殆ど全ての細胞は外界に"小胞"を分泌しており、これら小胞は細胞間の情報伝達を担っていると考えられている。ヒト血中の神経細胞由来細胞外小胞(NDE)を用いた「脳のリキッドバイオプシー」が近年大きな注目を集めている。現在提唱されている血中NDE分離法は抗体を用いた免疫沈降法であるが、非特異的な蛋白混入が多く実臨床に用いるには精度が不足している。
本研究では「大きさと密度」という2つの物理的性質に基づく分離法を用いた血中NDE分離法を検討する。更にアルツハイマー型認知症におけるNDE中のAβやリン酸化タウを測定することで、NDEを用いた血液バイオマーカーとしての有用性を検証する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は血中の細胞外小胞(EV)を大きさ及び密度に基づいて分離する手法を開発するものである。大きさに基づいた分離法はサイズ排除クロマトグラフィー分画法(SEC法)を、密度に基づいた分離法はイオジキサノール密度勾配分画法(IDG法)を採用した。
本年度はまずIDG法の高解像度化を試みた。既存の用手積層する形でのイオジキサノール密度勾配形成は分離幅が1.02-1.30g/mLとやや広く、EVと非EVを分離するには十分であるが、EVのうち特に神経に関連が強いサブ集団を特定するには不十分であると考えられた。そのため、機械での"tilted tube rotation"法を用いてEVをより細かく分画する方法を開発した。この手法は高濃度および低濃度のイオジキサノール溶液を積層したのち、一定の角度・スピード・時間で回転させる事で無段階の密度勾配を形成する事ができる。EVの密度帯である1.08-1.13g/mLを分離幅として、イオジキサノールの密度や回転の条件を最適化した。高解像度化したIDG法で血漿からEVを分離し、ウエスタンブロット法でEV関連蛋白(CD9)が適切に分画される事を確認した。またtunable resistive pulse sensing法を用いて、各分画に検出可能なレベルでEVが存在する事を確認した。粒子径分布は分画間でのオーバーラップが大きく、SECでの更なる分離が有効であると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
IDG法の高解像度化を予定通り完了した。SEC法の高解像度化も検討すべき条件を既に絞り込んでおり、取り組んでいる最中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は高解像度IDG法を用いて神経由来蛋白が存在する分画を特定し、並行してSEC法の高解像度化に取り組む。それらの結果を基に最適な分画を同定したのち、アルツハイマー型認知症患者の血漿から神経由来EV分画を分離し、EVの物的性質および神経由来蛋白の量を健常者のそれと比較する。
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