| Project/Area Number |
19KK0178
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| Research Category |
Fund for the Promotion of Joint International Research (Fostering Joint International Research (B))
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 43:Biology at molecular to cellular levels, and related fields
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
田中 良和 東北大学, 生命科学研究科, 教授 (20374225)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山下 恵太郎 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 客員共同研究員 (20721690)
松浦 友亮 東京工業大学, 地球生命研究所, 教授 (50362653)
喜多 俊介 北海道大学, 薬学研究院, 助教 (10702003)
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| Project Period (FY) |
2019-10-07 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥18,460,000 (Direct Cost: ¥14,200,000、Indirect Cost: ¥4,260,000)
Fiscal Year 2022: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2021: ¥5,070,000 (Direct Cost: ¥3,900,000、Indirect Cost: ¥1,170,000)
Fiscal Year 2020: ¥5,070,000 (Direct Cost: ¥3,900,000、Indirect Cost: ¥1,170,000)
Fiscal Year 2019: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
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| Keywords | 膜孔 / 黄色ブドウ球菌 / 蛋白質デザイン / 単粒子解析 / 膜孔形成タンパク質 / デザイン / 膜孔形成毒素 / 電子顕微鏡 |
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| Outline of Research at the Start |
膜孔は細胞膜上に形成された原子レベルで正確なナノメートルオーダーの孔である．最近，膜孔を利用した分子センサーが開発され，今後，膜孔を利用した更なる分子デバイスが開発できると期待されている．膜孔を用いた分子デバイスを開発する上で重要となるのが，直径，長さ，静電的性質などのナノポアの分子特性である．意図した機能の分子デバイスを創出するには，任意の分子特性（サイズ，静電的性質など）を持つ膜孔を自在にデザインする手法の開発が必要である．そこで本研究では，意図した形状の膜孔をデザインする技術を構築し，膜孔を用いた分子デバイスの開発を加速することを目指す．
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| Outline of Annual Research Achievements |
膜孔形成毒素は標的細胞の細胞膜に膜孔を形成する。膜孔は原子レベルで正確なナノメートルオーダーの孔（ナノポア）であり、これを利用した分子センサーが開発されている。更なる分子センサーの開発のために、目的に応じたサイズ・形状のナノポアを自在に作成できる技術が必要となる。本研究では、実験と計算科 学を併用して膜孔のデザインを実現し、任意の分子特性のナノポアを作り出すことを目指す。本研究では黄色ブドウ球菌の膜孔形成毒素に着目して分子デザインを実施する。黄色ブドウ球菌の膜孔形成毒素は、2種類に分類される。1つはホモ7量体の膜孔を形成するアルファヘモリジン、もう一方は、2種類の異なるポリペ プチド（LukF、Hlg2）が4分子ずつ会合してヘテロ8量体の膜孔を形成するガンマヘモリジンである。前年度までに種々のLukF、Hlg2のキメラタンパク質を作成し、それらの分子特性を生化学実験とネガティブ染色電顕により解析してきた。当該年度は、さらに多様なキメラタンパク質を作出し、その立体構造をクライオ電子顕微鏡単粒子解析により決定した。複数の変異体について高分解能の立体構造を決定することができ、意図した構造の会合体を形成していることがわかった。構造解析に際し、非常に強いプリファードオリエンテーションの問題があったが、グリッド作成の際の条件検討により、これを回避することができた。ポアの構造解析に適したグリッド作成及びデータ収集、構造解析の条件を決定することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
さまざまな人工膜孔を調製し、ネガティブ染色およびクライオ電顕による立体構造解析により、デザインしたポアを調製できていることが確認できている。高分解能構造解析のための条件も決定することができ、順調に進展していると考えた。特にクライオ電顕単粒子解析については、2オングストローム台の高分解能構造を決定するためのグリッド作成の手法を決定でき、複数の人工分子の高分解能構造を決定することに成功しており、大きく進展したと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
一部のキメラ体については、膜貫通領域の構造が安定せずに構造を確認できていない。これらのポアについては、リフォールディングの条件を精査して安定な試料が調製できる条件を探ることが重要となる。今後、安定なポアを調製した後、生化学実験による膜孔としての活性評価とクライオ電顕単粒子解析による構造学的裏付けを行い、さらに有用な分子のデザインへと応用する。海外での研究活動については、コロナウイルス感染拡大により十分な活動が実施できなかったため、次年度に繰り越して実施する。
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