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蛍光偏光を用いた等方性分解能顕微鏡の開発と細胞膜動態の可視化

Research Project

Project/Area Number 19KK0198
Research Category

Fund for the Promotion of Joint International Research (Fostering Joint International Research (B))

Allocation TypeMulti-year Fund
Review Section Medium-sized Section 48:Biomedical structure and function and related fields
Research InstitutionHokkaido University

Principal Investigator

大場 雄介  北海道大学, 医学研究院, 教授 (30333503)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 藤岡 容一朗  北海道大学, 医学研究院, 講師 (70597492)
佐藤 絢  北海道大学, 医学研究院, 博士研究員 (90854662)
Project Period (FY) 2019-10-07 – 2022-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2020)
Budget Amount *help
¥18,330,000 (Direct Cost: ¥14,100,000、Indirect Cost: ¥4,230,000)
Fiscal Year 2021: ¥7,800,000 (Direct Cost: ¥6,000,000、Indirect Cost: ¥1,800,000)
Fiscal Year 2020: ¥7,800,000 (Direct Cost: ¥6,000,000、Indirect Cost: ¥1,800,000)
Fiscal Year 2019: ¥2,730,000 (Direct Cost: ¥2,100,000、Indirect Cost: ¥630,000)
Keywords蛍光顕微鏡 / 偏光顕微鏡 / 等方性分解能 / 蛍光タンパク質 / 異方性
Outline of Research at the Start

ダイナミックな生命現象を理解には、空間軸(x, y, z 軸)と時間軸(t 軸)の4次元すべてに関する情報が必要である。しかし、技術的限界からこの4次元情報すべての高分解能計測は不可能である。本研究では、蛍光の偏光と異方性を活用し、これまであまり注目されていなかった分子の「向き」を検出することで、すべての方向において等しい分解能と高い時間分解能を有する観察系を構築する。これにより、エンドサイトーシスの初期過程など 細胞膜のダイナミクスの観察が可能となる。将来的には「角度」あるいは「向き」に着目した生物学の新領域の開拓や、生体膜のダイナミクスを理解する学術基盤の構築を目指したい。

Outline of Annual Research Achievements

緑色蛍光タンパク質 green fluorescent protein(GFP)の持つ異方性anisotropyを活用した角度センサーを開発した。これは二つの膜局在化シグナルによってGFPを細胞膜に固定したもので、GFPの発色団の向きと細胞膜の相対角度を一定に保った形で固定が可能となる。これによって、膜の傾きや曲率の変化により膜の蛍光偏光の角度が変化する。また、これらの膜局在化シグナルを様々な他の膜局在化シグナルに入れ替えた改変型角度センサー群も構築し、より高感度に膜の角度変化を検出すること、および細胞外刺激に応答して細胞膜の組成の変化を蛍光偏光の変化として検出することにも成功した。
また、角度センサーによって細胞膜の角度変化を計測するための全反射型蛍光偏光顕微鏡を自作し、稼働させている。この顕微鏡においては、励起光のxy方向の偏光は均一であるが、z方向成分については任意の向きに固定することが可能である。よって、この光学系を用いて上記の角度センサー群を発現する細胞を観察することで、一分子分解能による細胞膜の角度変化の測定が可能とした。
顕微鏡の性能確認には、共同研究先の米国マサチューセッツ州ウッズホールの海洋生物学研究所 Marine Biological Laboratory(MBL)のRudolf Oldenbourg博士およびResearch AdministratorのDana Mock-Munoz de Luna氏とコンタクトをとり2020年度の渡航予定を調整し、physiology course開催時期に訪問することを検討していたが、コロナ禍のため実現しなかった。顕微鏡開発についてはオンラインでの打ち合わせ以上のコミュニケーションの必要性に苦慮したが、なんとか予定通り完了した。現在はこの顕微鏡を用いて膜の動態観察をルーティンに行っている。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

研究の進捗はオンライン打ち合わせの活用等により当初の予定を維持したものの、本計画の一つの目玉であった若手研究者のリアルな交流がコロナ禍により実現しなかったため。

Strategy for Future Research Activity

2020年度に共同研究先を訪問して偏光顕微鏡開発を行う予定であったが、世界的なCOVID-19の拡大により、実現しなかった。次年度もおそらく実施不可能と予測されるので、オンラインでの会議により補完したりすることで、2021年度の研究を推進し、全研究期間終了後には当初の計画どおりあるいはそれ以上の成果を出せるように、一層の工夫をしながら進める予定です。

Report

(2 results)
  • 2020 Research-status Report
  • 2019 Research-status Report

Research Products

(22 results)

All 2020 2019 Other

All Int'l Joint Research (1 results) Journal Article (5 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Peer Reviewed: 5 results,  Open Access: 5 results) Presentation (16 results) (of which Int'l Joint Research: 3 results,  Invited: 3 results)

  • [Int'l Joint Research] Marine Biological Laboratory(米国)

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  • [Journal Article] Calcium Wave Promotes Cell Extrusion2020

    • Author(s)
      Takeuchi Y、Narumi R、Akiyama R、Vitiello E、Shirai T、Tanimura N、Kuromiya K、Ishikawa S、Kajita M、Tada M、Haraoka Y、Akieda Y、 Ishitani T、Fujioka Y、Ohba Y、Yamada S、Hosokawa Y、Toyama Y、Matsui T、Fujita Y
    • Journal Title

      Current Biology

      Volume: 30

    • DOI

      10.1016/j.cub.2019.11.089

    • NAID

      120006960639

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    • Author(s)
      Sayaka Kashiwagi, Yoichiro Fujioka, Takeshi Kondo, Aya O. Satoh, Aiko Yoshida, Mari Fujioka, Hitoshi Sasajima, Maho Amano, Takanori Teshima, Yusuke Ohba
    • Journal Title

      Cell Struct. Funct.

      Volume: 44 Issue: 2 Pages: 195-204

    • DOI

      10.1247/csf.19033

    • NAID

      130007775561

    • ISSN
      0386-7196, 1347-3700
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      Sayaka Kashiwagi, Yoichiro Fujioka, Aya O. Satoh, Aiko Yoshida, Mari Fujioka, Prabha Nepal, Atsushi Tsuzuki, Ozora Aoki, Sarad Paudel, Hitoshi Sasajima, Yusuke Ohba
    • Journal Title

      Cell Struct. Funct.

      Volume: 44 Issue: 2 Pages: 183-194

    • DOI

      10.1247/csf.19028

    • NAID

      130007775556

    • ISSN
      0386-7196, 1347-3700
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  • [Journal Article] Development of immortalized human tumor endothelial cells from renal cancer2019

    • Author(s)
      Nako Maishi, Hiroshi Kikuchi, Masumi Sato, Hiroko Nagao-Kitamoto, Dorcas A. Annan, Shogo Baba, Takayuki Hojo, Misa Yanagiya, Yusuke Ohba, Genichiro Ishii, Kenkichi Masutomi, Nobuo Shinohara, Yasuhiro Hida, Kyoko Hida
    • Journal Title

      International Journal of Molecular Sciences

      Volume: 20 Pages: 4595-4595

    • DOI

      10.3390/ijms20184595

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  • [Journal Article] Clinical efficacy and safety of first-line nilotinib therapy and evaluation of the clinical utility of the FRET-based drug sensitivity test.2019

    • Author(s)
      Kondo T, Fujioka M, Fujisawa S, Sato K, Tsuda M, Miyagishima T, Mori A, Iwasaki H, Kakinoki Y, Yamamoto S, Haseyama Y, Ando S, Shindo M, Ota S, Nishio M, Kurosawa M, Ohba Y, Teshima T, on behalf of the North Japan Hematology Study Group (NJHSG).
    • Journal Title

      International Journal of Hematology

      Volume: 110 Pages: 482-489

    • DOI

      10.1007/s12185-019-02696-w

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    • Author(s)
      佐藤絢、藤岡容一朗、大場雄介
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      藤岡容一朗,佐藤絢,吉田藍子,天野麻穂,皆川慶嘉,田端和仁,野地博行,大場雄介
    • Organizer
      第72回日本細胞生物学会大会
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  • [Presentation] 蛍光タンパク質の成熟促進化はミトコンドリアマーカー本来の局在を阻害する2020

    • Author(s)
      柏木 彩花、藤岡 容一朗、佐藤 絢、吉田 藍子、藤岡 真理、Nepal Prabha、続木 惇、 青木 大空、Paudel Sarad、笹島 仁、大場 雄介
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      第97回日本生理学会大会
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  • [Presentation] Live-cell imaging and analysis of the plasma membrane dynamics during clathrin-mediated endocytosis by high-speed atomic force microscopy2019

    • Author(s)
      A. Yoshida A、N . Sakai、N . Takahashi、S . H . Yoshimura、 Y . Ohba
    • Organizer
      ASCB|EMBO 2019
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  • [Presentation] Functional Analysis of Mitochondria-endosome Interaction in the Regulation of Endocytosis2019

    • Author(s)
      A. O. Satoh、Y .Fujioka、H. Sasajima、S . Paudel、A . Nanbo、Y . Ohba
    • Organizer
      ASCB|EMBO 2019
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      2019 Research-status Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Irs4 Mediates Egf-dependentUpregulation of Endocytosis through the Recruitment of Ras-pi3k Complex to the Endosome.2019

    • Author(s)
      M . Amano、Y. Fujioka、A . O . Satoh、K. Horiuchi、A . Yoshida、H. Sasajima、C . Obuse、 Y. Ohba
    • Organizer
      ASCB|EMBO 2019
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    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] インフルエンザウイルス粒子の細胞取り込み機構の解析2019

    • Author(s)
      藤岡 容一朗、佐藤 絢、吉田 藍子、笹島 仁、Sarad Paudel、皆川 慶嘉、田端 和仁、野地 博行、大場 雄介
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      第42回日本分子生物学会年会
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  • [Presentation] IRS4はRas ‐ PI3K複合体のエンドソーム局在化を介して依存性エンドサイトーシスを制御する2019

    • Author(s)
      天野 麻穂、藤岡 容一朗、佐藤 絢、堀内 浩水、吉田 藍子、笹島 仁、小布施 力史、大場 雄介
    • Organizer
      第42回日本分子生物学会年会
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  • [Presentation] Probing in vivo dynamics of plasma membrane during clathrin-mediated endocytosis2019

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      Aiko Yoshida、Nobuaki Sakai、Naoki Takahashi、Shige H. Yoshimura、Yusuke Ohba
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      第92回日本生化学会学会
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  • [Presentation] 細胞膜動態のcorrelative imaging2019

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      大場雄介
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      佐藤 絢、藤岡 容一朗、笹島 仁、 南保 明日香、大場 雄介
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      第71回日本細胞生物学会
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  • [Presentation] 蛍光タンパク質の成熟促進化はオルガネラマーカー本来の局在を阻害する2019

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      柏木 彩花、藤岡 容一朗、 笹島 仁、大場 雄介
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      第71回日本細胞生物学会
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  • [Presentation] Ras-PI3Kシグナルによるエンドサイトーシスの制御機構2019

    • Author(s)
      大場雄介
    • Organizer
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Published: 2019-10-10   Modified: 2021-12-27  

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