Molecular mechanisms of glutathione transport-dependent regulation of NLRP3 inflammasome

• Project/Area Number: 20F20408
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 外国
• Review Section: Basic Section 49070:Immunology-related
• Research Institution: Kumamoto University
• Host Researcher: 澤 智裕 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 教授 (30284756)
• Foreign Research Fellow: ZHANG TIANLI 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 外国人特別研究員
• Project Period (FY): 2020-11-13 – 2023-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2021)
• Budget Amount: ¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000); Fiscal Year 2022: ¥500,000 (Direct Cost: ¥500,000); Fiscal Year 2021: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000); Fiscal Year 2020: ¥600,000 (Direct Cost: ¥600,000)
• Keywords: インフラマソーム / グルタチオン / 自然炎症

Outline of Research at the Start

インフラマソームは生体内恒常性維持に欠かすことのできない重要な免疫応答である。これまでに、ATPによりマクロファージを刺激してインフラマソームを活性化すると、細胞内のグルタチオンが細胞外に放出されることを発見した（未発表データ）。本研究では、このグルタチオン放出に関わる制御機構の分子レベルでの解明を目指す。本研究の成果は、インフラマソームの制御異常が関わることが示唆されている多くの炎症性疾患に対する新しい治療法、診断法の構築に寄与することが期待される。

Outline of Annual Research Achievements

グルタチオンは細胞内の重要な抗酸化分子である。これまでにマクロファージをATPで刺激すると、グルタチオンが細胞外へ放出され、それが引き金となってインフラマソームと呼ばれる自然免疫応答が活性化されることを見出している（未発表データ）。本研究では、グルタチオン輸送によるインフラマソーム活性化の制御機構の分子基盤の解明を目指している。本年度は、（1）インフラマソーム活性化剤の種類によるGSH放出の違い、（2）マウス骨髄由来マクロファージにおけるGSH放出とインフラマソーム活性化、(3)マウス個体でのインフラマソーム活性に対するGSHおよびGSSGの影響、を中心に解析をすすめた。NLRP3インフラマソームの活性化は、マウスJ774.1細胞を大腸菌由来リポ多糖（LPS）で前刺激したのち、異なる刺激剤で本刺激を行った。具体的にはATP、nigericin、ネズミチフス菌感染、２本鎖DNA(poly dA:dT)による刺激によって活性化した。興味深いことに細胞内グルタチオンの放出はATP刺激のときにだけ観察された。またマウス骨髄由来マクロファージを同様にLPSとATPで刺激すると、細胞内グルタチオンの放出が確認された。マウス腹腔内にLPSとATPを投与するin vivoインフラマソーム活性化モデルを構築した。血漿中のIL-1βの増加を確認した。そのモデルにGSHあるいはGSSGを腹腔内投与すると、IL-1βの増加が有意に減少し、個体内においてもグルタチオン放出を介したインフラマソームの活性化が起こっている可能性が示唆された。これらの結果をまとめて論文発表した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

今年度は、ATP刺激によるマクロファージからのグルタチオン放出とインフラマソーム活性化の連関を明らかにし、その結果を論文発表できたため。

Strategy for Future Research Activity

2021年度以降は、ATP刺激がどのような仕組みによってグルタチオン放出をもたらしているのか、その分子基盤の解明に挑む。
グルタチオン化タンパク質の解析：NLRP3インフラマソームの活性化プロセスでタンパク質翻訳後修飾であるグルタチオン化がどのように変動するのかを、抗グルタチオン抗体を用いたWestern blotにて解析する。目的のグルタチオン化タンパク質のバンドをゲルから切り出してプロテオミクスにより同定する。
グルタチオントランスポーターの同定：ATP刺激によって引き起こされるグルタチオン輸送に関わるトランスポーターの同定を試みる。細胞外に放出されたグルタチオンをハイスループットで検出・定量できる測定システムを構築する。チオール反応試薬であるモノブロモビマンがグルタチオンと反応することを利用し、蛍光プレートリーダーで定量する。この解析は次年度も継続して行う。

Research Products

• [Journal Article] ATP exposure stimulates glutathione efflux as a necessary switch for NLRP3 inflammasome activation. (2021)
  • Author(s): Zhang, T., Tsutsuki, H., Islam, W., Ono, K., Takeda, K., Akaike, T. and Sawa, T.
  • Journal Title: Redox Biol. Volume: 41 Pages: 101930-101930
  • DOI: 10.1016/j.redox.2021.101930
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research