組織学と複合した単一細胞DNAメチル化解析法による原始卵胞淘汰過程の解明
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20H00471
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Medium-sized Section 44:Biology at cellular to organismal levels, and related fields
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| Research Institution | Nara Medical University |
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Principal Investigator |
栗本 一基 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (20415152)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2021)
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| Budget Amount *help |
¥44,460,000 (Direct Cost: ¥34,200,000、Indirect Cost: ¥10,260,000)
Fiscal Year 2022: ¥6,110,000 (Direct Cost: ¥4,700,000、Indirect Cost: ¥1,410,000)
Fiscal Year 2021: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2020: ¥8,840,000 (Direct Cost: ¥6,800,000、Indirect Cost: ¥2,040,000)
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| Keywords | LCM / DNAメチル化 / 生殖細胞 / PBAT / 配偶子形成 / シングルセル / 単一細胞 / トランスクリプトーム / 組織切片 / 形態 / 原始卵胞 / 単一細胞解析 / レーザーマイクロダイセクション |
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| Outline of Research at the Start |
生殖細胞系列は世代を越えた生命継承の要であり、その品質管理機構は発生学や生殖医学における重要な未解明問題である。胚生期に、特異なDNAメチル化プロファイルを獲得した卵母細胞は、支持細胞と密接に相互作用して原始卵胞を形成し、生涯に渡り激しい淘汰にさらされる。この過程では、卵子のもととなる卵母細胞が、支持細胞である顆粒膜細胞と密接に相互作用し、DNAメチル化を含むゲノムへの化学修飾に影響を与えながら、次の世代を発生させる準備を行うと考えられる。本研究では、卵巣の組織学的情報を得つつ、その組織切片から細胞を採取して遺伝子発現やDNAメチル化を単一細胞レベル解析する手法を開発し原始卵胞の淘汰過程を解析する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は切片からレーザーマイクロダイセクションで採取した細胞を想定した、微量ゲノムDNAをBisulfite処理して、Post bisulfite adaptor tagging (PBAT) ライブラリを調製する手法を検討した。既存のPBAT法（tPBAT）ではシングルセルレベルに適用するにはアダプターDNAが過剰である可能性のあることが示唆された。また切り出しに適した切片の詳細な形態観察を向上させるため、シムをスライドガラスとカバーガラスの間に挟みこんで、揮発性マウント剤を使用して鮮明な顕微鏡画像を得る手法を考案した。DNAメチロームデータの解析を行うための準備として、データ解析サーバーを導入し、セットアップを行った。切片からのcDNA増幅については、当初、まったく想定していなかった問題が発生した。本研究で使用してきたRNase inhibitorの一つが年度の途中で突如販売中止になった。代替のRNase inhibitorの選定と条件検討には難航したが、試行錯誤の結果、他のRNase inhibitorの添加量を工夫するなどして、これまでと同程度のRNaseの阻害活性を発揮する、RNase inhibitorとそれらの添加条件の組み合わせを同定することができた。またホルマリン固定されたサンプルに対してトランスクリプトーム解析やDNAメチローム解析が適用できれば、切片からの解析における利便性が各段に向上する。このため細胞をホルマリン固定して効率よくcDNA増幅ができるかを検討した。単一細胞レベルでの増幅はまだできていないが10細胞程度であれば通常の免疫染色に適用可能なきちんとした固定条件から過固定条件までの広い固定条件領域で生の細胞に近い効率での増幅ができることがわかりDNAメチル化解析との複合が期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、本研究で採用していた、研究代表者が長年使用してきた高品質なRNase inhibitorの製造中止が9月に判明し、代替品の検討が難航したが、最終的には適切な代替製品と条件を発見することができた。一方で、当初の予定を越えてホルマリン固定したサンプルからも効率のよいcDNA増幅ができることが判明し、固定組織からの全長RNA解析やDNAメチル化との複合が期待される結果を得た。これらの理由から、予定通りに進行している、と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今度に引き続き、微量DNAライブラリの作出手法を改善し、切片から回収された「シングルセルに適用可能なライブラリ作出条件を検討する。同時にホルマリン固定した細胞からのcDNA増幅手法を改善しシングルセルレベルで生細胞に比較可能な効率で遺伝子発現解析可能な手法にできるか検討する。
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Report
(2 results)
Research Products
(6 results)
