CRISPR/Casを用いた低温培養法によるノックイン動物の作製

• Project/Area Number: 20H00983
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: 3110:Agricultural chemistry, agricultural and environmental biology, forestry and forest products science, applied aquatic science, agricultural economics and rural sociology, agricultural engineering, veterinary medical science, animal science, and related fields
• Research Institution: Akita University
• Principal Investigator: Basaki Keita 秋田大学, 医学系研究科, 技術専門職員
• Project Period (FY): 2020-04-01 –
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2020)
• Budget Amount: ¥360,000 (Direct Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2020: ¥360,000 (Direct Cost: ¥360,000)
• Keywords: ゲノム編集 / CRISPR/Cas9 / ノックイン / マウス / CRISPR

Outline of Research at the Start

ゲノム編集技術によりノックアウト動物は容易に作出できるが、ドナーDNAをゲノムに導入するノックイン(KI)に関しては、その作出効率は極端に低い。
相同組み換えはG2期に起こるが、G2期の長い2細胞期胚にDNAコンストラクトを導入することでKI効率が向上することが報告されている。しかし、2細胞期胚の操作には高度な技術を要し、また、モザイク体が形成されやすいという問題点がある。
そこで、申請者は、胚を低温培養するとG2期が延長するため、相同組み換えが効率的に起こるのではないかと考え、検討することとした。本法では、特別な技術を必要としないため、KI動物作出の効率改善が期待できる。

Outline of Final Research Achievements

ゲノム編集技術によりノックアウト動物を容易に作出できるようになった一方で、相同組み換え修復（HR）を介してドナーDNAをゲノムに導入するノックイン（KI）動物の作出効率は極端に低い。そこで、本研究ではコンストラクトを注入した胚について低温培養で発生遅延を誘起してHRが起こるS期後半からG2期までを延長することで、KI効率が向上するか調査した。gRNA、Cas9、ドナーDNAを顕微注入した前核期胚を低温で培養したところ、37℃で培養した胚に比べてドナーDNAの導入効率が3倍程度向上した。このことから、低温培養によって胚の発生遅延が生じてHRが起こる機会が促進されることが示唆された。

Academic Significance and Societal Importance of the Research Achievements

CRISPR/Casシステムでは、HRにより長鎖DNAをゲノム上に導入するノックイン動物の作出は難しい。本研究では、低温培養によりS／G2期を延長してHRに十分な時間を確保することで、効率的にドナーDNAを導入した。本法は、特別な試薬を必要とせず、操作も簡易であり、ゲノム編集技術の新たな手法として有用であると考えられる。