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Establishment of regenerative medicine for musculoskeletal system using clinical-grade canine iPS cells

Research Project

Project/Area Number 20H03156
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (B)

Allocation TypeSingle-year Grants
Section一般
Review Section Basic Section 42020:Veterinary medical science-related
Research InstitutionNihon University

Principal Investigator

枝村 一弥  日本大学, 生物資源科学部, 教授 (80366624)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 村田 大紀  佐賀大学, 医学部, 助教 (00772683)
塩澤 誠司  久留米大学, 医学部, 准教授 (10447039)
鳩谷 晋吾  大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (40453138)
Project Period (FY) 2020-04-01 – 2023-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2021)
Budget Amount *help
¥15,210,000 (Direct Cost: ¥11,700,000、Indirect Cost: ¥3,510,000)
Fiscal Year 2022: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2021: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2020: ¥6,630,000 (Direct Cost: ¥5,100,000、Indirect Cost: ¥1,530,000)
Keywords再生医療 / 運動器疾患 / iPS細胞 / 間葉系幹細胞 / 犬 / 獣医
Outline of Research at the Start

本研究の概要は、臨床グレードの犬の人工多能性幹細胞(iPS細胞)を利用して、運動器疾患に対する細胞療法および再生医療の実用化を目指す研究である。まずは、犬のiPS細胞から均一性の高い間葉系幹細胞を作製し、変形性関節症の治療への応用を試みる。次いで、拒絶反応の少ない犬のiPS細胞の備蓄や、ゲノム編集技術を用いて拒絶反応が生じにくいiPS細胞の作製を試みる。最後に、犬のiPS細胞から培養軟骨や培養靱帯を作製する。本研究は、臨床グレードの犬のiPS細胞を用いた治療を具現化して動物の生活の質を著しく改善できるだけでなく、ヒトでの臨床応用に向けたトランスレーショナルリサーチとしても重要な成果が得られる。

Outline of Annual Research Achievements

本年度は以下の3項目の検討を行った。
1) 臨床グレードの犬のiPS細胞から間葉系幹細胞への分化誘導(枝村、鳩谷):本検討は、日本大学と大阪府大の2つの機関で実施した。まずは、TGF-β阻害剤とGSK阻害剤を含む培地で神経堤細胞を誘導し、間葉系幹細胞培地を用いて分化誘導を試みた。次いで、AMPK阻害剤を加えて神経堤細胞を誘導する方法も試みた。さらに、胚葉体を経由した方法も実施した。一部において紡錘形の細胞が認められたが、犬のiPS細胞から間葉系幹細胞への効率の良い分化誘導は得られなかった。一方、大阪府大で保有する株においては、TGF-β阻害剤を含んだ培地を用いることで、犬のiPS細胞から間葉系幹細胞への分化誘導へ成功した。
2) 拒絶反応の少ない犬のiPS細胞の備蓄および創生(枝村、塩澤):本年度は、拒絶反応の少ない犬のiPS細胞の作出を目的とし、iPS細胞のゲノム編集技術の確立を進めた。久留米大では、培養細胞におけるゲノム編集実施環境の整備を進め、対照実験に用いるガイドRNAの設計および作製を実施した。また、リプログラミング因子mRNA導入による高品質なiPS細胞株作出技術の開発のため、まず、体細胞への遺伝子導入法の検討を行った。対照としてEGFPをコードするmRNAを用い、脂質量および導入期間等を最適化した。さらに、日本大学では拒絶反応の起きにくいMHCホモ接合体の個体を同定する作業を進めた。
3) 臨床グレードの犬のiPS細胞から靭帯細胞への分化誘導法の開発(村田):本検討は、佐賀大学を中心に行った。ヒトiPS細胞由来間葉系幹細胞からなる細胞凝集塊を用いて、バイオ3Dプリンタにより牽引に対して強度を有するシート状の細胞構造体を造形し、自動で周期的な伸展刺激を一定期間与えることで、細胞と細胞外基質を牽引方向へと再配列させ、靭帯様の組織体を作製することに成功した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

多施設間で、問題点を共有しながら進めているので、概ね順調に推移している。実際には、臨床グレードのiPS細胞から間葉系幹細胞への分化誘導を試み、当初の計画に沿うように分化誘導法の有力な候補を見出すことができた(枝村、鳩谷)。拒絶反応の少ない犬のiPS細胞の備蓄については、MHCホモ接合体の個体の同定作業を行い、当該iPS 細胞の備蓄を計画通りに開始できている(枝村、塩澤)。一方で、ゲノム編集技術を用いた拒絶反応が生じにくい犬のiPS細胞の作製については遅れが生じている。犬のiPS細胞から靭帯組織への作製については、基礎実験が開始され、順調に進捗している(村田)。

Strategy for Future Research Activity

臨床グレードの犬のiPS細胞を用いた運動器再生医療を確立する目的で、今後も以下の4項目の検討を継続的に行う。
1) 犬のiPS細胞から分化誘導された治療用の間葉系幹細胞の臨床応用に向けた基礎的検討(枝村、鳩谷):本年度は、FACS等を用いて、犬のiPS細胞から間葉系幹細胞への分化誘導効率の高い細胞を分離する手法を試みる。さらに、より分化誘導効率の高い犬のiPS細胞株を作製および探索をする。また、前年度に作製した犬の臨床研究用の無血清培地を用いて培養した間葉系幹細胞の安全性評価を行う。その際には、SCIDマウスおよび正常犬を用いて造腫瘍試験と安全性試験を実施する。
2) 拒絶反応の少ないiPS細胞の備蓄および創生(枝村、塩澤):前年度に続き、拒絶反応の起きにくい犬白血球抗原(DLA)の組み合わせであるMHCホモ接合体の個体を同定し、MHCホモ接合型iPS 細胞を備蓄する。さらに、iPS細胞のゲノム編集技術を用いて、拒絶反応が生じにくい犬のiPS細胞を創生することも並行して行う。
3) 臨床グレードの犬のiPS細胞から軟骨への分化誘導法の開発(枝村):本検討は、前述した犬のiPS細胞由来間葉系幹細胞を用いて実施する。まずは、TGF-β、BMP-2、bFGFなどを含む軟骨分化誘導培地で三次元培養して、軟骨組織の作製を試みる。さらに、人工材料や異種動物由来材料を含む足場を用いずにiPS細胞から基質を有するより大きな培養軟骨を作製する。
4) 臨床グレードの犬のiPS細胞から靭帯細胞への分化誘導法の開発(村田):本検討も、犬のiPS細胞由来間葉系幹細胞を用いて実施する。まずは、bFGF、TGF-β、BMP-12、IGF、PDGFを組み合わせて、最適な靭帯細胞への分化誘導法を検討する。さらに、犬のiPS細胞由来の靭帯細胞または間葉系幹細胞を三次元で積層し、人工材料を用いずに靭帯組織を作製する。

Report

(1 results)
  • 2020 Annual Research Report

Research Products

(6 results)

All 2021 2020

All Journal Article (3 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results,  Peer Reviewed: 3 results,  Open Access: 3 results) Presentation (3 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Invited: 2 results)

  • [Journal Article] Non-viral Induction of Transgene-free iPSCs from Somatic Fibroblasts of Multiple Mammalian Species.2021

    • Author(s)
      Yoshimatsu S, Nakajima M, Iguchi A, Sanosaka T, Sato T, Nakamura M, Nakajima R, Arai E, Ishikawa M, Imaizumi K, Watanabe H, Okahara J, Noce T, Takeda Y, Sasaki E, Behr R, Edamura K, Shiozawa S, Okano H.
    • Journal Title

      Stem Cell Reports

      Volume: 16 Pages: 754-770

    • DOI

      10.1016/j.stemcr.2021.03.002

    • Related Report
      2020 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Generation and validation of a common marmoset embryonic stem cell line ActiCre-B1 that ubiquitously expresses a tamoxifen-inducible Cre-driver2021

    • Author(s)
      Yoshimatsu Sho、Ohtsu Kanae、Sato Tsukika、Yamamoto Masafumi、Sasaki Erika、Shiozawa Seiji、Okano Hideyuki
    • Journal Title

      Stem Cell Research

      Volume: 51 Pages: 102164-102164

    • DOI

      10.1016/j.scr.2021.102164

    • Related Report
      2020 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Direct Neuronal Reprogramming of Common Marmoset Fibroblasts by ASCL1, microRNA-9/9*, and microRNA-124 Overexpression2020

    • Author(s)
      Nemoto Akisa、Kobayashi Reona、Yoshimatsu Sho、Sato Yuta、Kondo Takahiro、Yoo Andrew S.、Shiozawa Seiji、Okano Hideyuki
    • Journal Title

      Cells

      Volume: 10 Pages: 6-6

    • DOI

      10.3390/cells10010006

    • Related Report
      2020 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Presentation] イヌとネコのiPS細胞2021

    • Author(s)
      鳩谷晋吾
    • Organizer
      第16回日本獣医再生医療学会
    • Related Report
      2020 Annual Research Report
    • Invited
  • [Presentation] 臨床グレードの犬のiPS細胞の創生および間葉系幹細胞への分化誘導法の開発2021

    • Author(s)
      山﨑敦史, 上田雄貴, 吉井友見, 井口青空, 塩澤誠司, 枝村一弥
    • Organizer
      第4回獣医幹細胞生物研究会
    • Related Report
      2020 Annual Research Report
  • [Presentation] Regenerative Medicine in the Field of Veterinary Orthopedic Surgery -Recent Evidence and Future Prospects-2020

    • Author(s)
      Kazuya Edamura
    • Organizer
      10th Asian Society of Veterinary Surgery Conference
    • Related Report
      2020 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research / Invited

URL: 

Published: 2020-04-28   Modified: 2022-04-19  

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