融合因子SOFの機能解析を通した精子－卵子の細胞膜融合機構の解明
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20H03172
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 42040:Laboratory animal science-related
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| Research Institution | Kumamoto University (2021)
Osaka University (2020) |
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Principal Investigator |
野田 大地 熊本大学, 大学院先導機構, 准教授 (50712551)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
原山 洋 神戸大学, 農学研究科, 教授 (30281140)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2021)
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| Budget Amount *help |
¥17,680,000 (Direct Cost: ¥13,600,000、Indirect Cost: ¥4,080,000)
Fiscal Year 2022: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2021: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2020: ¥5,200,000 (Direct Cost: ¥4,000,000、Indirect Cost: ¥1,200,000)
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| Keywords | 実験動物学 / 生殖生物学 / 発生工学 / 受精 / 精子 |
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| Outline of Research at the Start |
哺乳類の受精は、精子が卵子細胞膜と融合して雄性染色体を卵子へ送り込むと同時に、卵子を活性化することで完了する。精子と卵子の融合に注目すると、精子側ではIZUMO1、卵子側ではCD9とJUNOが精子-卵子の融合に必須な因子として同定されているが、融合メカニズムの解明には至っていない。本課題では、配偶子融合に関わるSOF1～3の生理学的機能の解析を通して、融合における分子メカニズムの解明を試みる。本研究で得られた成果は、雄性繁殖能力を予想するための新規分子マーカー開発などに応用できる。
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| Outline of Annual Research Achievements |
マウスの心臓、肝臓、脾臓、腎臓、脳、精巣、卵巣、および子宮を採取し、それぞれの組織からTotal RNAを抽出した。得られた各組織由来のTotal RNAから逆転写酵素を用いてcDNAを合成し、PCRを行ったところ、sperm oocyte-fusion required (Sof) 2やSof3は精巣で強く発現していた。Single cell RNAseqデータベースにより、Sof2～3 は特に精子細胞に多く存在することが分かった。
Sof2～3のコーディング領域内に数種類のguide RNAを設計した。gRNA/Cas9発現プラスミド（もしくはgRNAとCas9タンパク質）を受精卵に導入して、Sof2やSof3にそれぞれ変異を持つF0マウスを作製した。その後、交配させてSof2やSof3のsingle ノックアウト（KO）マウスを得た。これらのKO雄マウスと交配した雌マウスからは産子が得られなかった。
Sof2やSof3のコーディング領域をpETベクターやpGEXベクターに組み込み、大腸菌（BL21株）に導入して、SOF2やSOF3タンパク質を発現させた。精製タンパク質をKOマウス、ラットおよびハムスターに免疫して抗体作製を試みたものの、現在まで特異的に認識する抗体は作製できていない。そこで、アフィニティタグをSof2や3の翻訳領域のC末端側に結合させた発現ベクターを作製し、受精卵前核に注入してトランスジェニック（Tg）マウスを作製した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請書に記入した研究計画通りに研究を遂行できたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
作製したTgマウスの精巣や精子を使って、SOF2～3の検出や免疫沈降したタンパク質複合体の質量分析により相互作用する因子の同定を試みる。相互作用する因子が同定されたら、ゲノム編集技術により遺伝子改変マウスを作製して、精子－卵の融合メカニズムにおける役割を明らかにしたい。また、引き続き抗体作製にトライして、Izumo1などの融合関連因子を欠損した精子でのSOF2～3の性状を明らかにするとともに、抗体添加培地を用いた融合阻害実験によりSOF2～3で融合に関連する領域の特定に取り組みたい。
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Report
(1 results)
Research Products
(7 results)
