Investigation of genome function by upgrading replication cycle reaction

• Project/Area Number: 20H03238
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 43050:Genome biology-related
• Research Institution: Rikkyo University
• Principal Investigator: Su'etsugu Masayuki 立教大学, 理学部, 教授 (00363341)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥17,680,000 (Direct Cost: ¥13,600,000、Indirect Cost: ¥4,080,000); Fiscal Year 2022: ¥5,980,000 (Direct Cost: ¥4,600,000、Indirect Cost: ¥1,380,000); Fiscal Year 2021: ¥5,980,000 (Direct Cost: ¥4,600,000、Indirect Cost: ¥1,380,000); Fiscal Year 2020: ¥5,720,000 (Direct Cost: ¥4,400,000、Indirect Cost: ¥1,320,000)
• Keywords: DNA複製 / ゲノム動態 / 複製サイクル再構成系 / 試験管内再構成 / ボトムアップ合成生物学 / 複製サイクル / 転写翻訳 / 染色体 / 複製 / 転写 / 翻訳 / 大腸菌 / 再構成 / ゲノム / 再構成生物学 / 染色体複製 / 長鎖DNA

Outline of Research at the Start

大腸菌染色体複製のサイクルを再構成した複製サイクル再構成系では、ゲノムサイズの環状DNA分子の指数的な増幅が達成される。大腸菌をモデルとした研究では、複製系以外にも転写・翻訳、DNA修復、組換え、複製周期制御など、ゲノムにまつわる多くのシステムが試験管内再構成されている。本研究ではこれらシステムを複製サイクル再構成系に融合し、ゲノム動態の統合的な再現を目指す。システムだけでなくゲノム自体を試験管内に取り出しての再現も進める。試験管内に高度に再現されたゲノム動態に対し、従来細胞を対象に用いられてきたオミックス的解析手法を適用し、新しいアプローチでゲノム機能に迫る。

Outline of Final Research Achievements

In our originally developed replication cycle reconstitution system (RCR), which reconstitutes the cycle of E. coli chromosome replication, exponential amplification of genome-sized circular DNA molecules is achieved. In addition to the replication system, many other genome-related subsystems, such as transcription and translation, DNA repair, recombination, and replication cycle control, have been individually reconstituted in vitro in studies using E. coli as a model. In this study, these subsystems were integrated into the replication cycle reconstruction system to construct an integrated system that reconstructs genome dynamics. In addition to the system, we also examined the in vitro amplification of mega-sized genomes (chromosomes), and achieved full-length amplification of a 2-Mb fragmented chromosome.

Academic Significance and Societal Importance of the Research Achievements

複製サイクル再構成系（RCR）は、セルフリーで環状DNAを増幅する技術として、世界的に注目されており、本技術を基盤とするオリシロジェノミクス社はモデルナ社に買収されたことでも脚光を浴びた。本研究でアップグレードされた複製サイクル再構成系は、DNAを基盤とするバイオ創薬への展開が期待される。また、複製を皮切りに、細胞内のゲノム動態を試験管内で、より近似していく試みは、分子生物学の新しいアプローチとして生命の理解に繋がっていくものである。

Research Products

• [Journal Article] Enzymatic Supercoiling of Bacterial Chromosomes Facilitates Genome Manipulation (2022)
  • Author(s): Fujita Hironobu、Osaku Ayane、Sakane Yuto、Yoshida Koki、Yamada Kayoko、Nara Seia、Mukai Takahito、Su’etsugu Masayuki
  • Journal Title: ACS Synthetic Biology Volume: 11 Issue: 9 Pages: 3088-3099
  • DOI: 10.1021/acssynbio.2c00353
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] In vitro amplification of whole large plasmids via transposon-mediated oriC insertion (2021)
  • Author(s): Nara, S. and Su'etsugu, M.
  • Journal Title: BioTechniques Volume: 71 Issue: 4 Pages: 528-533
  • DOI: 10.2144/btn-2021-0068
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Grand scale genome manipulation via chromosome swapping in Escherichia coli programmed by three one megabase chromosomes (2021)
  • Author(s): Yoneji, T., Fujita, H., Mukai, T., and Su'etsugu, M.
  • Journal Title: Nucleic Acids Res. Volume: 49 Issue: 15 Pages: 8407-8414
  • DOI: 10.1093/nar/gkab298
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Amplification of Over 100 kbp DNA from Single Template Molecules in Femtoliter Droplets (2021)
  • Author(s): Ueno,H., Sawada,H., Soga,N., Sano,M., Nara,S., Tabata,K.V., Su’etsugu, M., Noji,H.
  • Journal Title: ACS Synthetic Biology Volume: 10 Issue: 9 Pages: 2179-2186
  • DOI: 10.1021/acssynbio.0c00584
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] 第22回 OriCiro Genomicsのセルフリー長鎖環状DNA合成技術 (2021)
  • Author(s): 末次 正幸
  • Journal Title: Farumashia Volume: 57 Issue: 3 Pages: 218-220
  • DOI: 10.14894/faruawpsj.57.3_218
  • NAID: 130007993278
  • ISSN: 0014-8601, 2189-7026
• [Journal Article] Overcoming the Challenges of Megabase-Sized Plasmid Construction in Escherichia coli (2020)
  • Author(s): Mukai Takahito、Yoneji Tatsuya、Yamada Kayoko、Fujita Hironobu、Nara Seia、Su’etsugu Masayuki
  • Journal Title: ACS Synthetic Biology Volume: 9 Issue: 6 Pages: 1315-1327
  • DOI: 10.1021/acssynbio.0c00008
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] <i>In vitro</i> Reconstitution of Replication Cycle of the <i>Escherichia coli</i> Chromosome and its Impact on Synthetic Biology (2020)
  • Author(s): SU’ETSUGU Masayuki
  • Journal Title: Seibutsu Butsuri Volume: 60 Issue: 5 Pages: 284-287
  • DOI: 10.2142/biophys.60.284
  • NAID: 130007919207
  • ISSN: 0582-4052, 1347-4219
  • Peer Reviewed
• [Presentation] In vitro統合再構成で紐解く細菌ゲノムの自己複製原理 (2022)
  • Author(s): 末次正幸
  • Organizer: 第45回日本分子生物学会年会
  • Invited
• [Presentation] In vitro再構成で明らかになってきた複製・転写・翻訳の協調的進行 (2022)
  • Author(s): 末次正幸
  • Organizer: 日本遺伝学会 第94回大会
  • Invited
• [Presentation] DNA メチル化による大腸菌染色体複製サイクル再構成系の制御 (2022)
  • Author(s): 加納 巧希、末次 正幸
  • Organizer: 第16回日本ゲノム微生物学会年会
• [Presentation] 人工ゲノム合成における DNA 配列エラーの解析 (2022)
  • Author(s): 小山拓也、末次正幸
  • Organizer: 第16回日本ゲノム微生物学会年会
• [Presentation] 大腸菌染色体複製と転写翻訳の協調的進行 (2022)
  • Author(s): 奈良聖亜、末次正幸
  • Organizer: 第16回日本ゲノム微生物学会年会
• [Presentation] 人工ゲノムのセルフリー合成 (2021)
  • Author(s): 末次正幸
  • Organizer: バイオインダストリー協会 発酵と代謝研究会
  • Invited
• [Presentation] 大腸菌のメガサイズゲノムの合成と移植の技術 (2021)
  • Author(s): 末次正幸
  • Organizer: 第73回 日本生物工学会大会 シンポジウム
  • Invited
• [Presentation] なぜ今、合成生物学なのか (2021)
  • Author(s): 末次正幸
  • Organizer: 日本科学哲学会第54回大会 特別講演
  • Invited
• [Presentation] メガサイズ染色体のバクテリア細胞への出し入れおよび増幅の技術 (2021)
  • Author(s): 末次正幸
  • Organizer: 第44回日本分子生物学会年会ワークショップ「細胞核を造る」
  • Invited
• [Presentation] 大腸菌ゲノムの分断化とポータブル化 (2021)
  • Author(s): 向井崇人、末次正幸
  • Organizer: 第17回21世紀大腸菌研究会
• [Presentation] 大腸菌サブ染色体の他細胞への移植 (2021)
  • Author(s): 吉田光輝、向井崇人、末次正幸
  • Organizer: 第17回21世紀大腸菌研究会
• [Presentation] 大腸菌ゲノムの試験管内複製 (2021)
  • Author(s): 藤田裕寛、末次正幸
  • Organizer: 第17回21世紀大腸菌研究会
• [Presentation] 複製遺伝子群をコードする環状DNAを鋳型にしたセントラルドグマの試験管内再構成 (2021)
  • Author(s): 川上直貴、長谷部友憲、高田啓、末次正幸
  • Organizer: 第17回21世紀大腸菌研究会
• [Presentation] 大腸菌染色体複製再構成系と転写・翻訳系との協調 (2021)
  • Author(s): 奈良聖亜、末次正幸
  • Organizer: 第17回21世紀大腸菌研究会
• [Presentation] メガスケールのDNA合成技術とその応用 (2021)
  • Author(s): 末次正幸
  • Organizer: 第2回 東京理科大学総合研究院合成生物学研究部門シンポジウム
  • Invited
• [Presentation] Masayuki Su'etsugu (2021)
  • Author(s): In vitro amplification of mega-sized circular DNA and its applications
  • Organizer: I2BCParisSaclay virtual seminar
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Remarks] 研究室webページ
  • URL: https://www2.rikkyo.ac.jp/web/sue-lab/
• [Remarks] 末次研究室HP
  • URL: https://www2.rikkyo.ac.jp/web/sue-lab/