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Deep phenotyping of human colorectal cancer evolution using adult stem cell organoids and CRISPR-Cas9 technology

Research Project

Project/Area Number 20H03757
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (B)

Allocation TypeSingle-year Grants
Section一般
Review Section Basic Section 55020:Digestive surgery-related
Research InstitutionKeio University

Principal Investigator

藤井 正幸  慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (00867575)

Project Period (FY) 2020-04-01 – 2023-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2021)
Budget Amount *help
¥17,810,000 (Direct Cost: ¥13,700,000、Indirect Cost: ¥4,110,000)
Fiscal Year 2022: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2021: ¥5,980,000 (Direct Cost: ¥4,600,000、Indirect Cost: ¥1,380,000)
Fiscal Year 2020: ¥7,540,000 (Direct Cost: ¥5,800,000、Indirect Cost: ¥1,740,000)
Keywords大腸がん / 転移 / オルガノイド / 遺伝子変異 / 発がん / 遺伝子スクリーニング / 遺伝子編集
Outline of Research at the Start

大腸の上皮に様々な遺伝子変異や染色体異常などの分子生物学的な異常が積み重なることで良性のポリープを経て大腸癌の発生に至るとされている.その過程において癌細胞は浸潤や転移する能力,いわゆる形質を獲得するが,悪性化に寄与する形質が遺伝子異常によってどのように誘導されるかについては,ヒト組織の形質を再現可能な実験ツールが欠如しておりほとんど明らかにされていない.本研究では組織幹細胞培養技術であるオルガノイド培養法,さらに遺伝子編集技術であるCRISPR-Cas9を用いた遺伝子スクリーニングを駆使し,大腸癌の発生過程における悪性形質獲得に働く分子を網羅的に探索する.

Outline of Annual Research Achievements

本邦および世界における大腸がん罹患患者数は増加の一途をたどっている.国際コンソーシアムによるシーケンス解析に代表される大規模解析を通じ,大腸がんにはいかなる遺伝子異常が生じているか明らかになりつつある.しかしながら,浸潤や転移といったがんに根源的な形質を説明する分子異常の理解はまだ不十分である.従来,大腸がんモデルとして癌細胞株や遺伝子改変マウスが頻用されてきたが,癌細胞株は臨床腫瘍の形質を完全に体現しているとは言い難く,マウスには種差や低スループット性等の難点がある.本研究ではオルガノイド技術を活用し臨床腫瘍組織から患者由来オルガノイドを樹立し,多角的な分子生物学的解析や遺伝子編集技術を駆使することで,ヒト大腸がんの表現型を規定する分子メカニズムに迫る.当該年度はその基盤となる複数の大腸癌オルガノイドの樹立し,エキソーム解析,トランスクリプトーム解析を通じて分子異常を把握した.さらに,転移や薬剤耐性をはじめとしたがんの表現型に寄与する遺伝子群をバイアスなく選出するため,患者由来オルガノイドを対象としたCRISPRノックアウトスクリーニングを立ち上げた.当該年度はスクリーニング系の妥当性,正確性の検証のため小さななライブラリスケールでのスクリーニングを実施し,オルガノイドの培養条件から予想される遺伝子が有意に濃縮されることを実証した.これらの成果により,臨床の腫瘍組織を模したオルガノイドを用いた遺伝子ノックアウトスクリーニングが可能となり,異種移植等の技術との統合によって大腸がんの悪性度に関わる浸潤や転移の分子レベルでの理解につながることが期待される.

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

1.患者由来大腸がんオルガノイドの統合的解析
当研究室が有する患者由来大腸腫瘍オルガノイドライブラリ(Fujii et al., Cell Stem Cell 2016)を拡充する形で,主に遠隔転移を伴う大腸がん症例よりオルガノイドを複数樹立した.樹立したオルガノイドの分子異常を把握するため,エキソーム解析による遺伝子変異解析,マイクロアレイあるいはRNAシーケンスによるトランスクリプトーム解析を行った.また,エピゲノム解析のため一部のオルガノイドを対象として,アセチル化ヒストン(H3K27Ac)のChIPシーケンス,ATACシーケンス,メチル化DNAマイクロアレイ解析を行った.これらの解析を通じ,本大腸癌オルガノイドライブラリは大腸がんの分子生物学的分類として提唱されている染色体不安定がん,ゲノム安定がん,マイクロサテライト不安定がんの全てを網羅していることを確認した.
2.患者由来大腸オルガノイドを対象としたノックアウトスクリーニング
大腸オルガノイドを用いた遺伝子ノックアウトスクリーニングを立ち上げるため,100遺伝子程度の小スケールライブラリによる検証を行った.CRISPRのガイドRNAは1遺伝子あたり4つ設計し,Humanized Cas9を強制発現させた大腸オルガノイドにレンチウイルスCRISPRライブラリを感染させた.ポジティブセレクションとしてオルガノイド培地に幾つかの阻害剤を添加し,そのターゲット遺伝子が選出されるかを検証したところ,期待されるガイドRNAが統計学的に有意に濃縮されることを確認した.再現実験でも同様の結果が得られ,スクリーニングの妥当性,正確性が実証された.

Strategy for Future Research Activity

網羅的ノックアウトスクリーニングを用いた大腸がん新規ドライバー遺伝子の探索
前年度の実績により,大腸腫瘍オルガノイドおよびCRISPRライブラリを用いた遺伝子ノックアウトスクリーニングが可能となった.今後は大腸腫瘍オルガノイド異種移植モデルにこのシステムを応用し,肝転移や浸潤,薬剤耐性等の大腸がんの表現型に寄与する遺伝子を探索する.当研究室の以前の研究により,大腸癌における代表的な遺伝子変異のみではこれらの形質は獲得されないことが判明しており(Matano et al., Nature Medicine 2015),本研究ではこの研究で樹立した人工大腸癌オルガノイドに大してポジティブセレクションスクリーニングを実施する.転移,浸潤をin vitroで正確に評価するのは困難であるため,ライブラリを感染させたオルガノイドを異種移植に用いることでスクリーニングを実施する.転移巣や浸潤部を大量に回収することは困難であるため,効率的なスクリーニングのため既知の浸潤,転移遺伝子,およびオルガノイドの分子解析から導出された遺伝子をピックアップし,ライブラリに用いることとする.薬剤耐性については,臨床で用いられている薬剤を中心に検討する.薬剤試験はin vitroで高スループットで実施可能なため,ゲノムワイドなライブラリでスクリーニングを行う予定である.

Report

(1 results)
  • 2020 Annual Research Report

Research Products

(8 results)

All 2021 2020

All Journal Article (7 results) (of which Int'l Joint Research: 3 results,  Peer Reviewed: 7 results,  Open Access: 6 results) Presentation (1 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Invited: 1 results)

  • [Journal Article] An organoid-based organ-repurposing approach to treat short bowel syndrome2021

    • Author(s)
      Sugimoto S, Kobayashi E, Fujii M, Ohta Y, Arai K, Matano M, Ishikawa K, Miyamoto K, Toshimitsu K, Takahashi S, Nanki K, Hakamata Y, Kanai T, Sato T.
    • Journal Title

      Nature

      Volume: 592 Pages: 99-104

    • DOI

      10.1038/s41586-021-03247-2

    • Related Report
      2020 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Wnt Signaling Shapes the Histologic Variation in Diffuse Gastric Cancer2021

    • Author(s)
      Togasaki K, Sugimoto S, Ohta Y, Nanki K, Matano M, Takahashi S, Fujii M, Kanai T, Sato T.
    • Journal Title

      Gastroenterology

      Volume: 160 Pages: 823-830

    • DOI

      10.1053/j.gastro.2020.10.047

    • Related Report
      2020 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Somatic cell-derived organoids as prototypes of human epithelial tissues and diseases2021

    • Author(s)
      Fujii M, Sato T.
    • Journal Title

      Nature Materials

      Volume: 20 Pages: 156-169

    • DOI

      10.1038/s41563-020-0754-0

    • Related Report
      2020 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] An Organoid Biobank of Neuroendocrine Neoplasms Enables Genotype-Phenotype Mapping2020

    • Author(s)
      Kawasaki K、Toshimitsu K、Matano M、Fujita M、Kudo Atsushi、Kitagawa Y、Kanai T、Nakagawa H、Sato T, et.al.
    • Journal Title

      Cell

      Volume: 183 Pages: 1420-1435

    • DOI

      10.1016/j.cell.2020.10.023

    • Related Report
      2020 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Linking human intestinal scaffolds and organoids to combat intestinal failure2020

    • Author(s)
      Masayuki Fujii, Shinya Sugimoto, Toshiro Sato
    • Journal Title

      Nature Medicine

      Volume: 26 Pages: 1517-1518

    • DOI

      10.1038/s41591-020-1096-9

    • Related Report
      2020 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Organoid Derivation and Orthotopic Xenotransplantation for Studying Human Intestinal Stem Cell Dynamics2020

    • Author(s)
      Shinya Sugimoto, Masayuki Fujii, Toshiro Sato
    • Journal Title

      Methods in Molecular Biology

      Volume: 2171 Pages: 303-320

    • DOI

      10.1007/978-1-0716-0747-3_21

    • Related Report
      2020 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Regulated IFN signalling preserves the stemness of intestinal stem cells by restricting differentiation into secretory-cell lineages2020

    • Author(s)
      Sato T, Ishikawa S, Asano J, Yamamoto H, Fujii M, Sato T, Yamamoto K, Kitagaki K, Akashi T, Okamoto R, Ohteki T.
    • Journal Title

      Nat Cell Biol.

      Volume: 22 Pages: 919-919

    • DOI

      10.1038/s41556-020-0545-5

    • Related Report
      2020 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] Microenvironmental regulation of somatic evolution and tumorigenesis2020

    • Author(s)
      藤井正幸,佐藤俊朗
    • Organizer
      第79回日本癌学会学術総会
    • Related Report
      2020 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research / Invited

URL: 

Published: 2020-04-28   Modified: 2022-04-19  

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