New therapeutic strategy for periodontal disease targeting exosomal miRNA derived from GMSCs.

• Project/Area Number: 20H03865
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 57030:Conservative dentistry-related
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 福田 隆男 九州大学, 大学病院, 講師 (80507781)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 武富 孝治 久留米大学, 医学部, 准教授 (10553290) ; 新城 尊徳 九州大学, 歯学研究院, 助教 (20711394) ; 讃井 彰一 九州大学, 大学病院, 講師 (70507780) ; 西村 英紀 九州大学, 歯学研究院, 教授 (80208222)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥17,810,000 (Direct Cost: ¥13,700,000、Indirect Cost: ¥4,110,000); Fiscal Year 2023: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000); Fiscal Year 2022: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2021: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2020: ¥7,410,000 (Direct Cost: ¥5,700,000、Indirect Cost: ¥1,710,000)
• Keywords: 歯肉幹細胞 / エクソソーム / miRNA / 歯周炎

Outline of Research at the Start

幹細胞による疾病治療効果には、幹細胞から分泌されるエクソソームと呼ばれる細胞分泌小胞が中心的役割を果たしており、エクソソームに内包されるmiRNAが損傷組織の遺伝子発現を制御することで治癒を促進することが明らかにされつつある。申請者らは歯肉幹細胞が分泌するエクソソームの有する著明な抗炎症・創傷治癒促進効果を発見したが、その詳細な分子基盤は不明である。
本研究は、歯肉幹細胞由来エクソソームmiRNAを新たな核酸創薬ターゲットとした新規歯周治療の分子基盤を確立することで、最小限の幹細胞から歯周病の炎症の収束・組織リモデリング・再生シグナルを効果的に誘導する革新的歯周治療法の確立を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

申請者らは歯肉幹細胞（GMSCs）が分泌するエクソソームの有する著明な抗炎症・創傷治癒促進効果に着目し、歯肉幹細胞由来エクソソームmiRNAを新たな核酸創薬ターゲットとした新規歯周治療の分子基盤を確立することを目的として研究を進めてきた。
一般的に、歯周炎による歯槽骨破壊には炎症性（M1）マクロファージが関与する一方で、歯周組織再生の成功には、炎症の終息と組織再生を担う修復型（M2）マクロファージの誘導が不可欠である。申請者はGMSCsを炎症性サイトカインであるTNF-α刺激することでnegative feedback機構が働き、GMSCs由来エクソソームによるM2マクロファージ誘導能が促進することを確認し、マウス創傷治癒モデルおいても著明な治癒促進効果を認めた。その分子機構について解析を行った結果、TNF-α刺激後のエクソソームで高発現した抗炎症分子CD73がM2マクロファージ誘導に重要であることを発見し、歯周炎への治療効果についてマウス歯周炎モデルで検証を行った結果、TNF-α刺激GMSCs由来エクソソームによる著名な歯槽骨吸収抑制効果を確認した。
GMSCsへのTNF-α刺激前後でのエクソソームmiRNAアレイ解析により、TNF-α刺激により誘導されたエクソソーム内miR-1260bが、破骨細胞活性化因子RANKLの発現を阻害をすることで骨吸収抑制効果の中心的役割を果たしていることが確認された。
更にGMSCsをTNF-α/IFN-αで共刺激した結果、優位なM2マクロファアージ誘導増強効果を確認した。一方、miR-1260bによる歯槽骨吸収の分子機構について検証を行った結果、miR-1260bは小胞体（ER）ストレス応答の制御を介して、破骨細胞分化の阻害し、歯槽骨吸収を抑制することが明らかとなった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

歯肉幹細胞をTNF-α/IFN-αで共刺激することでM2マクロファアージ誘導増強効果を確認し、さらにTNF-α誘導性エクソソームmiR-1260bのERストレス応答を介した骨吸収抑制機構について解明し、論文発表を行った。

Strategy for Future Research Activity

申請者らは、GMSCsをTNFによる炎症性サイトカイン刺激することでnegative feedback機構が働き修復型（M2）マクロファージ誘導能が促進することを確認しているが、IFN/TNF共刺激により更に増強効果が認められることを確認し論文発表した。さらに、エクソソーム内包miR-1260bがERストレス関連蛋白の抑制を介して骨吸収を抑制することを新たに論文発表した。以上の昨年度の研究成果をもとに、今年度は以下の解析を予定している。
歯肉幹細胞由来エクソソームmiRNAによるエピジェネティックな抗炎症機構の検証
マイクロアレイでリストアップされた主な変動上位miRNAをデータベースと照会し、クロマチンリモデリング関連蛋白を標的とするmiRNAの候補を検索する。これらmiRNAの炎症性サイトカインの遺伝子発現制御への関与について、以下の検証を行うことで詳細な抗炎症機構の解明が可能となる。
1. 候補miRNAをmiR-TALE-nucleaseシステムでノックアウトしたマクロファージを作成し、miRNAノックアウト前後のクロマチン免疫沈降シーケンス解析（ChiP-Seq）を行う。
2. ChiP-Seqの結果をGO（Gene Ontology）解析と併せて炎症性サイトカインプロモーター領域のヒストンメチル化を確認し、マクロファージにおける炎症性サイトカインの発現抑制効果を検討する。

Research Products

• [Journal Article] miR-582-5p targets Skp1 and regulates NF-κB signaling-mediated inflammation (2023)
  • Author(s): Li Rongzhi、Sano Tomomi、Mizokami Akiko、Fukuda Takao、Shinjo Takanori、Iwashita Misaki、Yamashita Akiko、Sanui Terukazu、Nakatsu Yusuke、Sotomaru Yusuke、Asano Tomoichiro、Kanematsu Takashi、Nishimura Fusanori
  • Journal Title: Archives of Biochemistry and Biophysics Volume: 734 Pages: 109501-109501
  • DOI: 10.1016/j.abb.2022.109501
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Development of a novel therapeutic approach for periodontitis that utilizes GMSCs-derived exosome through induction of M2 macrophage (2022)
  • Author(s): Fukuda Takao
  • Journal Title: Nihon Shishubyo Gakkai Kaishi (Journal of the Japanese Society of Periodontology) Volume: 64 Issue: 4 Pages: 109-115
  • DOI: 10.2329/perio.64.109
  • ISSN: 0385-0110, 1880-408X
  • Year and Date: 2022-12-28
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Extracellular vesicles derived from GMSCs stimulated with TNF-α and IFN-α promote M2 macrophage polarization via enhanced CD73 and CD5L expression. (2022)
  • Author(s): Watanabe Y, Fukuda T, Hayashi C, Nakao Y, Toyoda M, Kawakami K, Shinjo T, Iwashita M, Yamato H, Yotsumoto K, Taketomi T, Uchiumi T, Sanui T, Nishimura F.
  • Journal Title: Sci Rep Volume: 12(1) Issue: 1 Pages: 13344-13344
  • DOI: 10.1038/s41598-022-17692-0
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] miR-1260b inhibits periodontal bone loss by targeting ATF6β mediated regulation of ER stress. (2022)
  • Author(s): Hayashi C, Fukuda T, Kawakami K, Toyoda M, Nakao Y, Watanabe Y, Shinjo T, Sano T, Iwashita M, Yotsumoto K, Shida M, Taketomi T, Sanui T, Uchiumi T, Kanematsu T, Nishimura F.
  • Journal Title: Front Cell Dev Biol Volume: 10 Pages: 1061216-1061216
  • DOI: 10.3389/fcell.2022.1061216
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Exosomes from TNF-α-treated human gingiva-derived MSCs enhance M2 macrophage polarization and inhibit periodontal bone loss (2021)
  • Author(s): Nakao Yuki、Fukuda Takao、Zhang Qunzhou、Sanui Terukazu、Shinjo Takanori、Kou Xiaoxing、Chen Chider、Liu Dawei、Watanabe Yukari、Hayashi Chikako、Yamato Hiroaki、Yotsumoto Karen、Tanaka Urara、Taketomi Takaharu、Uchiumi Takeshi、Le Anh D.、Shi Songtao、Nishimura Fusanori
  • Journal Title: Acta Biomaterialia Volume: 122 Pages: 306-324
  • DOI: 10.1016/j.actbio.2020.12.046
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Immunomodulatory Role of Exosomes Derived from Gingival Mesenchymal Stem Cells (2020)
  • Author(s): 福田 隆男
  • Journal Title: The Japanese Journal of Conservative Dentistry Volume: 63 Issue: 2 Pages: 140-143
  • DOI: 10.11471/shikahozon.63.140
  • NAID: 130007840631
  • ISSN: 0387-2343, 2188-0808
• [Presentation] miR-1260b inhibits periodontal bone loss by targeting ATF6β (2022)
  • Author(s): Hayashi C, Kawakami K, Toyoda M, Watanabe Y, Nakao Y, Yotsumoto K, Yamato H, Shinjo T, Sanui T, Fukuda T, Nishimura F.
  • Organizer: The 108th Annual Meeting of the American Academy of Periodontology
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Fabrication of stem cell-based scaffold-free bone-like 3D structures. (2022)
  • Author(s): Toyoda M, Kajioka S, Fujimoto R, Hayashi C, Kawakami K, Watanabe Y, Nakao Y, Yotsumoto K, Sanui T, Fukuda T, Nakayama K, Nishimura. F.
  • Organizer: The 108th Annual Meeting of the American Academy of Periodontology
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 歯肉幹細胞由来エクソソームのM2マクロファージ誘導 を介した革新的歯周治療の開 (2022)
  • Author(s): 福田隆男
  • Organizer: 第65回春季日本歯周病学会学術大会
  • Invited
• [Presentation] 歯肉幹細胞由来エクソソーム内包miR-1260bによる小胞体ストレス応答制御を介した歯周炎骨吸収抑制効果 (2022)
  • Author(s): 林千華子、福田隆男、渡邊ゆかり、川上賢太郎、豊田真顕、中尾雄紀、四本かれん、大和寛明、新城尊徳、讃井彰一、西村英紀
  • Organizer: 第65回春季日本歯周病学会学術大会
• [Presentation] バイオ3Dプリンターを用いた、間葉系幹細胞からの骨様立法構造物作製への挑戦 (2022)
  • Author(s): 豊田真顕、梶岡俊一 、福田隆男 、渡辺ゆかり 、林千華子 、川上賢太郎 、中尾雄紀、四本かれん 、大和寛明 、讃井彰一 、西村英紀
  • Organizer: 第65回春季日本歯周病学会学術大会
• [Presentation] TNF-α/IFN-α共刺激した歯肉幹細胞由来エクソソームはCD73とCD5Lを介して抗炎症性M2マクロファージを誘導する (2022)
  • Author(s): 渡邊ゆかり、林千華子、川上賢太郎、豊田真顕、中尾雄紀、大和寛明、四本かれん、新城尊徳、岩下未咲、讃井彰一、福田隆男、西村英紀
  • Organizer: 第156回日本歯科保存学会2022年度春季学術大会
• [Presentation] ヒト歯髄細胞由来マイクロベジクル含有PKRを標的とした歯髄鎮静薬および歯内・歯周病変モデルの作成に向けて (2022)
  • Author(s): 川上賢太郎、渡邊ゆかり、林千華子、豊田真顕、新城尊徳、讃井彰一、福田隆男、西村英紀
  • Organizer: 第156回日本歯科保存学会2022年度春季学術大会
• [Presentation] バイオ３Dプリンターを用いた、間葉系幹細胞からの骨様立法構造物作製への挑戦 (2022)
  • Author(s): 豊田真顕、梶岡俊一 、川上賢太郎 、林千華子 、渡邊ゆかり 、中尾雄紀 、四本かれん 、讃井彰一 、福田隆男 、西村英紀
  • Organizer: 令和4年度日本歯周病学会九州五大学 日本臨床歯周病学会九州支部合同研究会
• [Presentation] ヒト歯髄細胞由来マイクロベジクル含有PKRを標的とした歯髄鎮静薬および歯内・歯周病変モデルの作成に向けて (2022)
  • Author(s): 川上賢太郎、渡邊ゆかり、林千華子、豊田真顕、新城尊徳、讃井彰一、福田隆男、西村英紀 ヒ川上賢太郎、渡邊ゆかり、林千華子、豊田真顕、新城尊徳、讃井彰一、福田隆男、西村英紀
  • Organizer: 第157回日本歯科保存学会2022年度秋季学術大会
• [Presentation] 歯肉幹細胞由来エクソソームを応用した歯周炎治療の開発に向けて (2022)
  • Author(s): 福田隆男
  • Organizer: 第45回日本分子生物学会 バイオテクノロジーセミナー
  • Invited
• [Presentation] 歯肉幹細胞由来エクソソーム 内包miR-1260bによる小胞体ストレス応答制御を介した抗炎症作用 (2021)
  • Author(s): 林千華子、福田隆男、渡邊ゆかり、川上賢太郎、豊田真顕、中尾雄紀、四本かれん、大和寛明、新城尊徳、讃井彰一、西村英紀
  • Organizer: 第64回春季日本歯周病学会学術大会（WEB開催）
• [Presentation] Exosomes derived from GMSCs stimulated with TNF-α and IFN-α promote M2 macrophage polarization via enhanced CD73 and CD5L expression. (2021)
  • Author(s): Yukari Watanabe, Chikako Hayashi, Kentarou Kawakami, Masaaki Toyoda, Yuki Nakao, Karen Yotsumoto, Hiroaki Yamato, Takanori Shinjyo, Terukazu Sanui, Takao Fukuda, Fusanori Nishimura
  • Organizer: The 69th Annual Meeting of Japanese Association for Dental Research (Hybrid Meeting)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Exosomal miR-1260b derived from TNF-α-treated hGMSCs inhibits periodontal bone loss by targeting ATF6β-mediated regulation of ER stress. (2021)
  • Author(s): Chikako Hayashi, Takao Fukuda, Yukari Watanabe, Kentaro Kawakami, Masaaki Toyoda, Yuki Nakao, Karen Yotsumoto, Hiroaki Yamato, Takanori Shinjo, Terukazu Sanui, Fusanori Nishimura
  • Organizer: The 69th Annual Meeting of Japanese Association for Dental Research (Hybrid Meeting)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 歯肉幹細胞由来エクソーム内包miR-1260bによる小胞体ストレス応答制御を介した歯槽骨吸収抑制作用 (2021)
  • Author(s): 林千華子、福田隆男、渡邊ゆかり、川上賢太郎、豊田真顕、中尾雄紀、四本かれん、大和寛明、新城尊徳、讃井彰一、西村英紀
  • Organizer: 第155回日本歯科保存学会2020年度秋季学術大会（WEB開催）
• [Presentation] Exosomal miR-1260b derived from TNF-α-treated hGMSCs inhibits periodontal bone loss by targeting ATF6β-mediated regulation of ER stress. (2021)
  • Author(s): Chikako Hayashi, Takao Fukuda, Yukari Watanabe, Kentaro Kawakami, Masaaki Toyoda, Yuki Nakao, Karen Yotsumoto, Hiroaki Yamato, Takanori Shinjo, Terukazu Sanui, Fusanori Nishimura
  • Organizer: Kyudai Oral Bioscience & OBT Research Center 5th Joint International Symposium
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Exosomes secreted from TNF-α-preconditioned gingival tissue-derived stem cells s enhance M2 macrophage polarization and inhibit periodontal bone loss (2021)
  • Author(s): Takao Fukuda
  • Organizer: Kyudai Oral Bioscience & OBT Research Center 5th Joint International Symposium 2021
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Therapeutic potential of exosomes derived from GMSCs in periodontal disease (2020)
  • Author(s): Yuki Nakao, Takao Fukuda, Yukari Watanabe, Chikako Hayashi, Kentaro Kawakami, Masaaki Toyoda, Karen Yotsumoto, Hiroaki Yamato, Takanori Shinjyo ,Urara Tanaka, Terukazu Sanui, Fusanori Nishimura
  • Organizer: The 106th Annual Meeting of the American Academy of Periodontology in collaboration with the Japanese Society of Periodontology
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Exosomes from TNF--treated human gingiva-derived MSCs inhibit periodontal bone loss via miR-1260b-mediated RANKL inhibition (2020)
  • Author(s): Yuki Nakao, Takao Fukuda, Yukari Watanabe, Chikako Hayashi, Kentaro Kawakami, Masaaki Toyoda, Karen Yotsumoto, Hiroaki Yamato, Takanori Shinjyo ,Urara Tanaka, Terukazu Sanui, Fusanori Nishimura
  • Organizer: The 68th Annual Meeting of Japanese Association for Dental Research
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 歯肉幹細胞由来エクソソームは、miR-1260bによるRANKL阻害により歯槽骨吸収を抑制する (2020)
  • Author(s): 中尾雄紀、福田隆男、渡邊ゆかり、林千華子、川上賢太郎、豊田真顕、四本かれん、 大和寛明、新城尊徳、田中麗、讃井彰一、西村英紀
  • Organizer: 第153回日本歯科保存学会2020年度秋季学術大会
• [Presentation] 歯肉幹細胞GMSC由来エクソソームによるCD73を介した免疫制御機構 (2020)
  • Author(s): 渡邊ゆかり、福田隆男、中尾雄紀、林千華子、川上賢太郎、豊田真顕、四本かれん、 大和寛明、讃井彰一、西村英紀
  • Organizer: 第153回日本歯科保存学会2020年度秋季学術会
• [Book] 幹細胞由来EV~治療,診断,化粧品への展開~第2回 歯肉幹細胞由来エクソソームを応用した歯周炎治療の開発に向けて (2022)
  • Author(s): 福田隆男
  • Total Pages: 28
  • Publisher: 和光純薬時報 巻： 90 号： 4 ページ： 10-11 発行年： 2022年10月15日
• [Remarks] 九州大学大学院歯学研究院口腔機能修復学講座歯周病学分野
  • URL: https://www.dent.kyushu-u.ac.jp/perio/index.html