SBDDを利用した多発性骨髄腫治療薬IMiDsの医薬分子設計

• Project/Area Number: 20K06526
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 43020:Structural biochemistry-related
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 森 智行 東京大学, 定量生命科学研究所, 助教 (30623227)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2021)
• Budget Amount: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000); Fiscal Year 2022: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000); Fiscal Year 2021: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2020: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
• Keywords: 多発性骨髄腫 / 免疫調節薬 / SBDD / 構造生物学 / Ｘ線結晶構造解析 / セレブロン / ユビキチンリガーゼ複合体 / サリドマイド / 免疫調節薬(IMiDs) / CRBN / IKZF1/3 / E3ユビキチンリガーゼ

Outline of Research at the Start

免疫調節薬(IMiDs)と総称されるサリドマイド(商標名サレド)とその改良薬レナリドミド(レブラミド)、ポマリドミド(ポマリスト)は、多発性骨髄腫に対する特効薬である。これまでに申請者は、IMiDsの薬理効果の分子機構の詳細を調べる目的で、IMiDs存在下において、IMiDsの標的タンパク質CRBNと、多発性髄腫細胞の増殖にかかわるタンパク質IKZF1/3の分子複合体の三次元立体構造の情報をX線結晶構造解析の手法を用いて取得してきた。本研究では、これらの分子複合体の構造情報を基礎にして効率よくIMiDsを設計して、多発性骨髄腫に対してより薬理効果の高い次世代のIMiDs候補の選抜を行う。

Outline of Annual Research Achievements

サリドマイドの改良薬である免疫調節薬(immunomodulatory drugs: 以下IMiDs)は難病である多発性骨髄腫の特効薬であり、より薬理効果の高いIMiDs改良薬の開発が期待されている背景がある。IMiDsが直接結合する標的タンパク質は、ユビキチンリガーゼE3複合体(E3複合体)の基質受容体であるcereblon(CRBN)である。IMiDsはCRBNに結合して、多発性骨髄腫細胞の増殖因子である転写因子IKZF(IKAROS zinc-finger transcription factors 1/3)との結合親和性を高める「分子糊」として働く。IMiDsは、CRBNとIKZFの結合親和性を高めて、E3複合体によるIKZFのユビキチン化を促進してユビキチン-プロテアソーム系によるIKZFの分解を促進することで、細胞内のIKZF濃度を下げて多発性骨髄腫細胞の増殖を抑える薬理効果が発揮される。
これまでに、申請者は、IMiDsとCRBNの複合体構造解析をX線結晶構造解析の手法を用いて明らかにしてきた。そして、近年、市販のIMiDsであるサリドマイド、ポマリドミド、レナリドミドを使って、IMiDs-CRBN-IKZF三者複合体のX線立体構造解析に成功している。本研究では、これら分子複合体の立体構造情報を利用して、タンパク質複合体立体構造情報を基礎とした薬剤設計法(SBDD: structure-based drug design method)を用いて、効率的にIMiDsを改良して薬理効果の高い次世代IMiDs化合物を分子構造レベルの情報を基に選抜していく事を目的としている。これまでに市販のIMiDs化合物を使用して得られた構造情報をもとに、IMiDsのアナログ化合物を複数設計した。これらのIMiDsアナログを使用してCRBNとIKZFとの複合体結晶を得ている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

昨年度同様、世界的なコロナウイルス感染症の拡大にともなう物流の停滞、化合物入手が困難などの不可抗力事由があったために当初の計画よりも、やや遅れがある。
これまでの進歩状況としては、CRBNタンパク質は、すでに論文発表してある既存の精製系を使用して大量に得た。IKZFは、大腸菌を用いた発現系を用いて精製系を確立して高純度のタンパク質を得ている。また、IKZFは、IMiDsアナログ化合物を使用した結晶化において、結晶構造解析に足る分解能を得るために発現領域の検討も行っている。また、市販のIMiDsであるサリドマイド、ポマリドミド、レナリドミドを使ったIMiDs-CRBN-IKZFの3者複合体のX線立体構造解析情報をもとにして、いくつかのIMiDsアナログ化合物、すなわちサリドマイド、ポマリドミド、レナリドミドにヒドロキシル基を付加したヒドロキシサリドマイド(Thal-OH)、ヒドロキシポマリドミド(Pom-OH)、ヒドロキシレナリドミド(Len-OH)を設計した。新たに設計したこれらのIMiDsを用いて、IMiDs、CRBN、IKZFを混合したタンパク質溶液を用いて結晶化条件のスクリーニングを行って、複数の結晶化条件を得た。得られた結晶化条件から、CRBN単体やIKZF単体の結晶を除去するために、得られた結晶のSDS-PAGEやX線回折実験複合と構造解析による電子密度から結晶の選抜を行い、安定して複合体結晶が得られる条件の絞り込みを行った。そして、分子複合体結晶と思われる結晶化条件をいくつか得ている。これまでに、Thal-OHを使用したCRBN-IKZF複合体については分解能3オングストローム程度の回折像を得ており、構造解析に足る、さらなる高分解能の結晶が得られる条件を検討している最中である。

Strategy for Future Research Activity

昨年度同様、世界的なコロナウイルス感染症の拡大にともなう物流の停滞、化合物入手が困難などから当初の計画よりも、遅れがある。IMiDs アナログ化合物の存在下でのCRBN-IKZF複合体の三者複合体結晶化条件のスクリーニングと結晶化条件の最適化については、遅れながらも順調に推移している。今後、Ｘ線結晶構造解析に足る分解能が得られる結晶を得るために、より迅速に結晶化条件の最適化を進める。具体的には、結晶化条件に添加剤スクリーニングや、発現コンストラクトの見直しを進める。また、IMiDs存在下でのCRBNとIKZFの結合親和性を調べるために、溶液系での相互作用解析も進めていく。これまでに、IMiDs存在下でのCRBNとIKZFとの結合は、溶液系ではGST融合タンパク質を用いたGSTプルダウンアッセイ法では検出できないほど弱い結合であることが明らかとなっている。そのため、より高感度な相互作用解析の装置を使用する必要があると考えている。具体的には、等温滴定カロリーメトリー(ITC)や、表面プラズモン共鳴センサー（SPI)、バイオレイヤー干渉法(BLI)を用いて解析を進めている。