| Project/Area Number |
21659100
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Experimental pathology
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
篠原 美都 京都大学, 医学研究科, 助教 (10372591)
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| Project Period (FY) |
2009 – 2010
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2010)
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| Budget Amount *help |
¥3,000,000 (Direct Cost: ¥3,000,000)
Fiscal Year 2010: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2009: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
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| Keywords | 遺伝学 / 発生・分化 / 幹細胞 / バイオテクノロジー |
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| Research Abstract |
精子幹細胞の長期培養系(Germline Stem :GS細胞)は、2年以上の培養後も精巣内移植により正常な子孫を産生する。胎生期の精巣から樹立された細胞(embryonic Germline Stem : eGS細胞)は、独特のエピジェネティック異常を伴う。本研究ではこれらの細胞の差異に着目し、ヒストン修飾の異常と精子幹細胞のインプリンティング遺伝子の発現制御機構の関わりを調べた。
1) ノックアウトマウスやRNAi法によるヒストン修飾酵素欠損eGS細胞、GS細胞の樹立
マイクロアレイのデータをもとにGS細胞で発現の高いヒストン修飾遺伝子28個を候補として選び、レンチウイルスにてshRNAによるノックダウンを行った。COBRA法にてH19やIgf2rなどGS細胞のインプリンティング領域のメチル化に変化はなかったが、Ash11, Ash21, Jarid2, Ehmt1, Setd2, Setd3, Chd1遺伝子ノックダウンではGS細胞の増殖や生存に影響を及ぼした。その細胞死がp53に依存するものか否かを調べるためp53欠損GS細胞に同遺伝子のノックダウンを行った結果、Chd1について細胞死をレスキューできた。これはChd1による細胞死がp53遺伝子依存性であることを示唆する。しかしChd1遺伝子をノックダウンされたp53欠損GS細胞においてH19のDNAメチル化に変化は見られなかった。
2) eGS細胞の樹立ステージの拡大
これまでに用いてきた培地では胎生12.5日以降のPGCからのみeGS細胞の樹立が可能であった。これを改変することにより、胎生8.5-11.5日のPGCの培養を行った。樹立された細胞についてRT-PCR法やフローサイトメトリーにより遺伝子発現パターンを調べるとともに、COBRA法にて調べたインプリンティング遺伝子のメチル化の異常の有無を調べたが、培養細胞においては胎生12.5日以降のPGC由来のものと類似した結果が得られた。
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