Creリコンビナーゼを利用した誘導調節可能な単一細胞モザイク解析法の開発・最適化

Research Project

Project/Area Number	21930013
Research Category	Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	基礎医学
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	岡村理子 The University of Tokyo, 大学院・医学系研究科, 技術専門職員
Project Period (FY)	2009
Project Status	Completed (Fiscal Year 2009)
Budget Amount *help	¥590,000 (Direct Cost: ¥590,000) Fiscal Year 2009: ¥590,000 (Direct Cost: ¥590,000)
Keywords	RNA干渉 / Creリコンビナーゼ
Research Abstract	目的:細胞系譜特異的・時期特異的に発現誘導可能なRNA干渉法を単一細胞レベルで行い、モザイク表現型解析を可能とするベクター系の構築を目的とした。方法および成果:初めに発現誘導可能なRNA干渉用ベクターとして、(1)shRNA発現プロモーター中に改変型loxPを導入し、Cre作用後、shRNAが発現するベクター(2)Cre作用後に、miRNAが発現するベクター(3)FLIP型miRNA発現ベクター:Cre発現前は、miRNAは、プロモーターに対して逆向きに挿入されているため発現しないが、Cre作用後2種類のloxPが特異的に反応し、プロモーター下流で、miRNAとmCherry(赤色蛍光蛋白質)が発現するベクターを構築した。次に培養細胞(HEK293T)において発現抑制効果を免疫染色法にて検討した。Creと(1)のベクターの共発現では、改変型loxPが機能せず、目的遺伝子の発現抑制が見られなかった。(2)のベクターでは、発現抑制が確認されたが、miRNA発現リークのためCre作用前に一部発現抑制が見られてしまっていた。(3) FLIP型miRNA発現ベクターでは、遺伝子発現抑制とmCherry発現を確認でき、Cre作用前のリークもなく誘導可能なベクターであった。続いて、まずCreの寄与がないmiRNA発現ベクターを子宮内電気穿孔法で導入しin vivoで単一細胞レベルの表現型が確認された。次に細胞系譜特異的・時期特異的プロモーター下でCreを発現するベクターを、Cre下流でGFPを発現するベクターと共に導入しCreの作用効果について検討した。その結果、Cre発現用のプロモーター特異性は確認された。ただし、その下流の遺伝子発現の細胞系譜特異性・時期特異性を実用的に制御するためには、さらに改変型Creを用い、効率を向上することが望ましいと考えられた。