| Project/Area Number |
21H02156
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 38060:Applied molecular and cellular biology-related
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
橋本 渉 京都大学, 農学研究科, 教授 (30273519)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小倉 康平 京都大学, 農学研究科, 准教授 (00586612)
三上 文三 京都大学, 生存圏研究所, 研究員 (40135611)
老木 紗予子 京都大学, 農学研究科, 助教 (40843090)
高瀬 隆一 京都大学, 農学研究科, 助教 (10842156)
渡辺 大輔 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 准教授 (30527148)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥17,550,000 (Direct Cost: ¥13,500,000、Indirect Cost: ¥4,050,000)
Fiscal Year 2023: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000)
Fiscal Year 2022: ¥5,070,000 (Direct Cost: ¥3,900,000、Indirect Cost: ¥1,170,000)
Fiscal Year 2021: ¥7,670,000 (Direct Cost: ¥5,900,000、Indirect Cost: ¥1,770,000)
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| Keywords | 腸内細菌叢 / 動物宿主 / 相利共生 / ムチン / グリコサミノグリカン / 微生物叢 / 常在機構 / 膜小胞 / プロバイオティクス / Bacteroides / γ-アミノ酪酸 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、主要な腸内優占菌（BacteroidesとStreptococcus属細菌）に焦点を当て、その優占性を示す要因を細菌と動物宿主の両者の観点から解析し、相利共生機構を明らかにする。具体的には、腸内優占菌がヒトを含む動物宿主由来の分泌性粘液物質（糖タンパク質ムチンや多糖グリコサミノグリカン等）を栄養源として増殖し、その過程で動物宿主の健康を増進する代謝産物を提供することを実証する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒトを含む動物は、組織の骨格形成や維持等のため、種々の粘液物質（糖タンパク質ムチンや多糖グリコサミノグリカンGAG等）を分泌する。これらの粘液物質は常在細菌にとって格好の栄養素である。本研究では、主要な腸内優占菌（BacteroidesとStreptococcus属細菌）に焦点を当て、その優占性を示す要因を細菌と動物宿主の両者の観点から解析し、相利共生機構を明らかにすることを目指す。今年度は以下の成果を得た。
Bacteroides属細菌を対象に50種以上を調べた結果、過半数が粘液物質（ムチンまたはGAG）を資化することを明らかにしている。本菌におけるGAGの代謝機構を解析した結果、GAGの分解により生じる不飽和ウロン酸に作用する初発代謝酵素系（イソメラーゼとレダクターゼ）をRNAシーケンスによる遺伝子発現と組換え酵素の機能解析により分子同定した。
B. ovatusとB. thetaiotaomicronが粘液物質を資化する際、必須アミノ酸や短鎖脂肪酸を分泌することを見いだしている。粘液物質を含むヒト培養細胞用培地で培養した両菌の各培養濾液は、ヒト腸管由来Caco-2細胞の増殖を促進した。また、両菌は粘液物質から著量のγ-アミノ酪酸（GABA）を産生したことから、腸内に優占するBacteroides属細菌数種についても調べたところ、優占種はGABAを分泌生産することが判明した。
Streptococcus属細菌は腸内のみならず口腔内にも常在する。口腔内にも粘液物質が存在することから、口腔内細菌を対象にGAG存在下で優占する細菌叢を解析した。その結果、Granulicatella属細菌が占有率を増加させ30-40%を占めるに至った。
以上のことから、Bacteroides属細菌は、高頻度で粘液物質資化性を示すとともに宿主に有益物質を提供することから腸内優占性を獲得していることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
50種以上のBacteroides属細菌を対象に粘液物質資化性を評価したところ、20種以上がムチン資化性を、30種以上がGAG資化性を示すことを見いだした。16S rRNA配列に基づいた系統樹と粘液物質資化性レベルを照合したところ、粘液物質資化性が本菌の普遍的な特徴であることがわかり、本菌の腸内優占性と粘液物質資化性との強い相関が示された。実際に、特に腸内に高優占する約10種のBacteroides属細菌のほぼ全てが粘液物質資化性を示す。さらに興味深いことに、Bacteroides属細菌の腸内優占種がGAG分解性を示す膜小胞を分泌し、GAG資化性を示さないBacteroides属細菌種の生育を助長することから、Bacteroides属細菌が協調的に作用して、腸内最優占種として君臨している可能性が示された。
Bacteroides属細菌の腸内優占種が粘液物質を資化する際、必須アミノ酸や短鎖脂肪酸を分泌し、その培養濾液はヒト腸管細胞の増殖を促進する。特に、γ-アミノ酪酸（GABA）の生産量は顕著であり、精神安定作用と血圧降下作用の両面に有効な摂取目安量と同等のGABA分泌が確認された。
これらの結果は、当初の計画以上の成果として、Bacteroides属細菌が動物宿主由来粘液物質を資化することにより腸内優占性を獲得するとともに、本菌が動物宿主に有益物質を提供するという相利共生機構を解明する学術的基盤の確立につながるものである。また、腸内優占Bacteroides属細菌が粘液物質分解性を示す膜小胞を分泌する知見は腸内細菌叢の形成に重要な視座を与える成果と期待される。腸内環境に加えて、口腔内・腸内常在細菌であるGranulicatella属細菌は、宿主から恒常的に分泌される内因性のヒアルロン酸（GAGの一種）を資化することにより常在性を獲得したことが示唆される。一方、歯肉退化治療としての歯肉へのヒアルロン酸注入に際して、病原性Granulicatella属細菌の優占増殖に注意する必要があると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
主要なヒト腸内優占菌（BacteroidesとStreptococcus属細菌）に焦点を当て、その優占性を示す要因を細菌と動物宿主の両者の観点から解析し、相利共生機構を明らかにすることを目指すため、以下の方策で本研究を推進する。
Bacteroides属細菌の粘液物質資化機構に関して、GAG分解により生じる不飽和ウロン酸の代謝系酵素を同定できたことから、X線結晶構造解析によりそれらの酵素の構造機能相関を明らかにする。具体的には、イソメラーゼとレダクターゼを対象に結晶化を行い、立体構造を決定する。さらに、リガンド結合の複合体の構造解析を進め、当該酵素の反応機構を解明する。
資化機構に関連する細胞内取り込み系について、Streptococcus属細菌による粘液物質成分の細胞内輸送系としてホスホトランスフェラーゼシステム（PTS）を明らかにしているが、Bacteroides属細菌による細胞内取り込みについては不明な点が多い。そのため、Bacteroides属細菌の細胞内に取り込まれる基質とその輸送体の同定を試みる。また、Streptococcus属細菌のPTSについて、その構造機能解析を進める。
膜小胞を介した腸内優占菌の生存戦略を明らかにするため、腸内優占菌の膜小胞の回収機能を調べる。具体的には、腸内優占菌が遊離した膜小胞を、再度、腸内優占菌の細胞が膜融合により膜小胞を回収する可能性を解析する。
ヒトと腸内優占菌との間の相利共生機構を明らかにするため、腸内優占菌とヒト腸管細胞との相互作用に関して、細菌接着の観点から解析する。具体的には、粘液物質を介した相互作用の有無を調べ、粘液物質が腸内優占菌の栄養素のみならず、接着のための足場として機能している可能性を評価する。また、動物組織（例：ブタ腸管）を用いて、腸内優占菌とその膜小胞の組織内動態を解析し、腸内優占菌と動物組織との相互作用様式を明らかにする。
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