Biomedical application of fish collagen: Development of the bone-mimetic collagen-fibril coating on the titan-made bone implant

Research Project

Project/Area Number	21H04731
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
Allocation Type	Single-year Grants
Section	一般
Review Section	Medium-sized Section 40:Forestry and forest products science, applied aquatic science, and related fields
Research Institution	Hokkaido University
Principal Investigator	都木靖彰北海道大学, 水産科学研究院, 教授 (10212002)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	浦和寛北海道大学, 水産科学研究院, 准教授 (90360940) 東藤正浩北海道大学, 工学研究院, 教授 (10314402)
Project Period (FY)	2021-04-05 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2024)
Budget Amount *help	¥41,860,000 (Direct Cost: ¥32,200,000、Indirect Cost: ¥9,660,000) Fiscal Year 2024: ¥9,750,000 (Direct Cost: ¥7,500,000、Indirect Cost: ¥2,250,000) Fiscal Year 2023: ¥9,620,000 (Direct Cost: ¥7,400,000、Indirect Cost: ¥2,220,000) Fiscal Year 2022: ¥10,140,000 (Direct Cost: ¥7,800,000、Indirect Cost: ¥2,340,000) Fiscal Year 2021: ¥12,350,000 (Direct Cost: ¥9,500,000、Indirect Cost: ¥2,850,000)
Keywords	コラーゲン原線維コーティング / 再生医療チタン材料 / 表面加工 / 骨誘導 / 水産廃棄物利用 / コラーゲン線維コーティング / 再生医療用チタン材料
Outline of Research at the Start	海外産と比べ高価ではあるが厳格な生産管理が可能な国産水産物由来コラーゲンの特長を活かし，高付加価値な医療利用を実現する。再生医療分野ではコラーゲン製の人工骨を用い，骨再生を効率的に誘導することが期待されているが，人工骨の機械強度がまわりの骨よりも小さく，機能性が低いことが課題となっている。本研究では，チョウザメの浮袋コラーゲンがもつ高い線維形成能を利用して哺乳類コラーゲンでは実現不可能な高配向性コラーゲン線維材料を形成し，これに骨と同等のリン酸カルシウム結晶を沈着させ，真に骨の構造を模倣した「骨ミメティック構造」の創出をめざす。
Outline of Annual Research Achievements	(a) 骨ミメティック構造の創出：　2021年度に創出した方法を改良し，石灰化誘起溶液のCa・Pi濃度を再調整し，細胞培養ウェル底面に一様に石灰化したコラーゲン線維層をコーティングすることに成功した．X線回折（XRD）解析ではヒドロキシアパタイト（HA）結晶のピークが観察され，生体骨同様にHA結晶が沈着していることが証明された．ただし，そのCa/P比は約1.4で，HA結晶の理論値（1.67）より低く，HA以外の結晶体を少量含むと予想された．（b）チタン材料表面への骨ミメティックコート技術の開発：　Yabutsuka (2020)を参考として，チタン材料表面にHA結晶をコーティングした．その結果，アルカリSBFと正常SBFに順番に浸漬することで，結晶を成長させ得ることを示した．成長した結晶にはHAが含まれることが示唆されたが，Ca/P比は1.3程度と他の結晶成分が混在する可能性があり，HAの存在比を増加させる必要がある．なお，チタン材料表面にコーティングした結晶層にコラーゲン原線維をコーティングすることにも成功したが，線維の配向性が低かった．今後この点の改良が必要である． (c) 骨ミメティック構造に対する幹細胞反応性の解明：　まず原線維コーティング上にヒト骨髄由来間葉系幹細胞（hMSC，ロンザ株式会社）を培養し，骨芽細胞分化指標として頻用されるアルカリフォスファターゼ（ALP）活性とアリザリンレッド（AR）染色による石灰化物の検出を試みたところ，前者ではALP抽出時にコーティングしたコラーゲン層も抽出されるという問題が生じた．また，後者ではコラーゲン層が自発的に石灰化してAR陽性となることが示され，両者を用いた定法では骨芽細胞分化状態の把握ができなかった．現在，qPCRを用いた幹細胞の遺伝子発現プロファイルの解析技術開発を進めている．
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 研究実績の概要に述べたとおり，本年度に計画していた実験はほぼ順調に進んだが，① チタン表面にコーティングした結晶中にはHA結晶が含まれるものの，HA以外の結晶体も含まれており，HA結晶の形成効率を高める必要がある，② コラーゲン原線維コーティングの特徴から，hMSCの骨芽細胞分化能を定法により定量的に示すことが困難であり，これを明確に示す遺伝子指標の確率が必要，の2点の課題が明確になった．対策として，①に関してはチタン材料表面へのポリドーパミンコーティングを起点とするHA誘導法など，新たな方法を試験する必要がある．また，②に関してはすでにいくつかの遺伝子発現定量法を開発したが，総合的に判断するため，もう少し測定する遺伝子数を増やす必要がある． ①，②ともに，課題克服のための実験は始めたが，22年度中には修了しておらず，23年度に持ち越すこととなった．
Strategy for Future Research Activity	2023年度は，課題（a）に関してはイオンビームを用いた区kロスセクションポリッシャを用い，線維の断面を露出して，生体骨同様に線維内までHA結晶が析出していることを証明する．課題（b）に関しては，現在までの進捗状況に述べた課題①の対策である新規HA誘導法を用いた研究を推進し，Ca/P比がHAの理論値に近い結晶体を誘導する．課題（c）に関しては，現在の実験を進め，十分な数の遺伝子定量技術を確立し，骨ミメティック構造（石灰化コラーゲン層）上でのhMSC培養をおこない，その遺伝子発現プロファイルを明らかにする．