Structural analysis of cFLIP as an iron-binding protein and elucidation of a new physiological function
Project/Area Number |
21K05380
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Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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Allocation Type | Multi-year Fund |
Section | 一般 |
Review Section |
Basic Section 38030:Applied biochemistry-related
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Research Institution | Kyoto University |
Principal Investigator |
酒巻 和弘 京都大学, 生命科学研究科, 准教授 (20271017)
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Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
富井 健太郎 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 情報・人間工学領域, 研究チーム長 (40357570)
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Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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Keywords | 鉄結合タンパク質 / Fenton反応 / 鉄硫黄タンパク質 / フェロプトーシス / 分子進化 / 偽プロテアーゼ |
Outline of Research at the Start |
本研究は、「偽プロテアーゼ」と定義されたcFLIPが進化の過程で機能喪失分子から鉄硫黄タンパク質に変貌し、アポトーシスだけでなくフェロプトーシスによる細胞死も抑制することを明らかにする。そのため、大腸菌から精製したタンパク質について種々の解析手法とバイオインフォマティクスの手法を併せることにより、鉄結合タンパク質としての構造上の特性を明確にする。また鉄イオンと活性酸素種の反応によって誘導されるフェロプトーシスに対してcFLIPが鉄を捕捉することで抑制的に作用することを示す。これらを遂行することで、cFLIPを介して活性酸素種から細胞を守り生存力を高める機構が存在することを示す。
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Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、大腸菌よりcFLIPのリコンビナント-タンパク質の精製と、リコンビナントを使った生化学的解析を中心に進めた。初段階から単一タンパク質としての精製は困難であることが判明したため、MBPとの融合タンパク質として改良を施すことで結果として精製が可能となった。精製したリコンビナントを使ってFenton反応への抑制効果の有無を調べたところ、抑制作用が認められた。また、cFLIPを発現する大腸菌は、コントロールの細胞に比べて過酸化水素水に対して耐性を示すことが明らかとなった。一方、システイン残基(Cys259)をアラニンに置換したcFLIP変異体を発現する大腸菌の場合は、耐性を失うことも認めた。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
【リコンビナント-タンパク質の精製について】 単一タンパク質として単離・精製するのではなく、MBPとの融合タンパク質として単離・精製する工夫を施すことにより、タンパク質の凝集や分解を抑制することに繋がり、生化学的解析に用いることができる収量を得ることが可能になった。 【生化学的解析について】 上述の精製リコンビナントを使ってFenton反応の抑制効果を調べたところ、予め期待した通りの結果を得ることができた。 【細胞学的解析について】 In vitroの結果と同様に大腸菌を使った実験においても、cFLIPが存在することで過酸化水素による酸化作用に対して大腸菌が耐性を示すことを見い出せた。
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Strategy for Future Research Activity |
1. 生化学的解析によるcFLIPの特質の解明 本研究の主目的の一つ、cFLIPが鉄結合タンパク質であることを生化学的手法によって明らかにする。 2. FLIPの新規機能の証明 培養細胞を用いて、cFLIPがフェロプトーシスによる細胞死を抑制できることを新たに立証する。そして偽プロテアーゼと定義されているcFLIPが進化に伴い新たな機能を獲得したことを示唆する。
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Report
(2 results)
Research Products
(1 results)