Molecular basis and functional modulation of carbohydrate epimerases and isomerases useful for carbohydrate conversion
| Project/Area Number |
21K05388
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 38030:Applied biochemistry-related
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
佐分利 亘 北海道大学, 農学研究院, 准教授 (00598089)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | マンノース2-エピメラーゼ / セロビオース2-エピメラーゼ / オリゴ糖 / 糖質 / 異性化 / キメラ酵素 / エピメラーゼ / イソメラーゼ |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では，セロビオース2-エピメラーゼ (CE) を用いた反応特異性の分子基盤の解明とマンノース2-エピメラーゼ (ME) の高活性変異酵素の開発を行う．CEに関しては，各種変異酵素の機能・構造解析，基質アナログへの反応解析を通じ反応特異性を支配する構造因子を解明する．MEに関する研究では，大腸菌外膜での組換え酵素生産系とマンノース資化能を失った変異株を用いた効率的高活性変異酵素スクリーニング技術を構築し，高活性変異酵素を開発する．
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| Outline of Annual Research Achievements |
糖質の高度利用には，希少糖質の効率合成法が必要である.本研究ではセロビオース2-エピメラーゼ (CE酵素) や マンノースイソメラーゼなど様々な糖質異性化酵素を含む酵素群の反応特異性を制御する機構の解明と高活性変異酵素の開発を目的とした.エピメラーゼ活性のみを示すCE (1機能CE酵素) とエピメラーゼ活性とイソメラーゼ活性を示す2機能CE酵素の間で構造領域を入れ換えた一連のキメラ酵素のうち，(α/ α)6バレル触媒ドメインを構成するα-ヘリックス1と2，3と4，5と6を入れ替えたキメラ酵素の機能を解析した．Glcβ-4ManとGlcβ-4Fruに対する初速度に基づき2機能CE酵素に1機能CE酵素のα-ヘリックス1と2，3と4を入れ換えたキメラ酵素は野生型2機能酵素よりも低いイソメラーゼ特異性を示した.すなわち，α-ヘリックス１から4に至る領域がイソメラーゼ反応に重要な構造を含むことが示唆された．マンノースエピメラーゼ (ME酵素) については高活性変異酵素のハイスループットスクリーニング系の評価を行った．ME酵素をマンノース取り込み能を欠失させた大腸菌の細胞表層に発現させたところ，この細胞懸濁液中でのManの減少を確認した．すなわち，マンノースは菌体外ME酵素によるグルコースへの異性化を介して菌体に取り込まれたと理解された．またこの大腸菌形質転換体はマンノースを唯一の炭素源として生育した．組換えME酵素のC末端側にGFPタンパク質を融合し，菌体表層中のME酵素の簡便な定量方法を構築した．ランダム変異を導入したME変異酵素ライブラリーをグルコースとマンノースを唯一の炭素源とする培地で生育させるとマンノース培地でのコロニー数はグルコース培地でのコロニー数の5%程度であり，低活性変異酵素はマンノース培地で生育できずに除外されることが示唆された．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
CE酵素については当初目的としていたエピメラーゼ-イソメラーゼ特異性を決定する構造要素を含む領域を明らかにすることができた．ME酵素については生育能に基づき酵素活性を評価できることが示唆されており，高活性変異酵素のスクリーニングのための基盤が整備された．
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| Strategy for Future Research Activity |
CE酵素のキメラ酵素の中で(α/ α)6バレル触媒ドメインを構成するα-ヘリックス1と2，3と4を入れ替えたものについてはイソメラーゼ特異性の低下が確認されたため，構造解析を実施する．高活性型ME酵素の取得に向けてスクリーニング，機能・構造解析を進める．
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Report
(2 results)
Research Products
(4 results)
