Investigation of cell-cell adhesion structures and signaling pathways causing collective invasion in cancer cells
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21K07142
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 50010:Tumor biology-related
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
芳賀 永 北海道大学, 先端生命科学研究院, 教授 (00292045)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小林 純子 (仁尾純子) 長崎大学, 高度感染症研究センター, 准教授 (70447043)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
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| Keywords | 細胞・組織 / がん細胞 / 集団浸潤 / 細胞間接着構造 / 電子顕微鏡 |
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| Outline of Research at the Start |
がんは無秩序に無限増殖する細胞の集合体であり，がんが全身に広がることは患者の予後を悪化させる．がんが転移する過程で，がん細胞が周囲の間質中に移動することを浸潤という．培養細胞を用いた浸潤に関する研究の多くは，これまで単一の細胞を対象に行われてきた．しかし，実際の生体内においては，多くのがん細胞種は細胞間の接着を維持したまま集団で浸潤する．このことを集団浸潤という．しかし，その機序については不明な点が多い．そこで本研究は，がん細胞にみられる細胞間接着構造と細胞間に形成される仮足構造を観察・解析するとともに，それらの構成分子およびシグナル経路を明らかにすることで集団浸潤の普遍的機序に迫る．
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| Outline of Annual Research Achievements |
多くのがん細胞種は細胞間接着を維持しながら集団で周囲の間質中に浸潤する．このことを集団浸潤という．その機序については不明な点が多い．本研究は，がん細胞にみられる細胞間接着構造に着目し，それらの構成分子およびシグナル経路を明らかにすることで集団浸潤の機序に迫る．研究計画として，①集団浸潤をもたらすシグナル経路の探索，②細胞間に特異的に見られる仮足構造の解析，③集団浸潤の普遍性の確認を立案し，それぞれの実験を逐次実施した．令和4年度までに得られた研究実績を以下に記す．
①について：ヒト皮膚扁平上皮がん細胞株（A431細胞）から高浸潤と低浸潤のサブクローン株を樹立し，マイクロアレイ，RNA干渉法，免疫蛍光染色，阻害剤投与などの実験を行った結果，高浸潤サブクローン株ではインターフェロンβ（INFB）が細胞間隙に蓄積しSTAT1が活性化することで集団浸潤が誘引されることが明らかとなった．この結果は，原著論文として令和4年5月にOncogenesis誌に出版するに至った．さらに，CCL5という分泌タンパク質が集団浸潤を誘引することを新たに明らかにした．
②について：がん細胞集団の仮足構造と集団浸潤への影響を調べることを目的として，仮足を形成するために必要とされているタンパク質群の発現をRNA干渉法を用いてノックダウンし，位相差顕微鏡でタイムラプス観察を行ったが，いまのところ有意な結果は得られていない．
③について： 複数のがん細胞株をコラーゲンゲル中に3次元包埋培養し，タイムラプス観察を行ったが，いまのところ集団浸潤を示す細胞株は得られていない．一方で，榎本篤教授（名古屋大学・医学部）の協力によってヒト臨床検体の解析を行った結果，ヒト臨床検体においてもSTAT1の活性化が集団浸潤の亢進に関与することが示唆された．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和4年度も研究実施計画をほぼ順調に遂行することができた．とくに，研究計画①集団浸潤をもたらすシグナル経路の探索については目覚ましい成果が得られ，原著論文の出版に加えて，集団浸潤を誘引する物質としてCCL5という分泌タンパク質を見出すことができた．CCL5はこれまで乳がんや前立腺がんにおいて，がん細胞の増殖，浸潤に関与することが知られていた．A431細胞においてCCL5のmRNA発現量を調べたところ，高浸潤のサブクローン株では低浸潤のサブクローン株に比べて15倍以上も発現していることが明らかとなった．さらに，高浸潤のサブクローン株において，RNA干渉法を用いてCCL5の発現をノックダウンし，3次元コラーゲンゲル包埋下で蛍光観察を行ったところ，集団浸潤が有意に抑制されることが明らかとなった．加えて，CCL5のノックダウンによって，INFBとSTAT1の発現が抑制されるという興味深い結果を得た．
研究計画②細胞間に特異的に見られる仮足構造の解析については，浸潤能の異なるサブクローン間においてケラチンファミリーの発現に有意な差があることが明らかとなったが，集団浸潤に関わる細胞間接着や仮足形成タンパク質の同定には至っていない．マイクロアレイの結果を再度検討することで，仮足形成と集団浸潤の関係を明らかにしたい．
研究計画③集団浸潤の普遍性の確認については，ヒト臨床検体において，STAT1の活性が集団浸潤の亢進に関与することを見出すことができた．一方で，浸潤能が高い各種がん細胞株をコラーゲンゲル中に3次元包埋培養したところ，集団浸潤は示さずに，個々の細胞がバラバラに浸潤する様子が観察された．実験で用いたコラーゲンゲルが生体内の間質に比べて軟らか過ぎる可能性があるので，コラーゲンの濃度を上げる，あるいはコラーゲンを架橋するなどの検討を行う予定である．
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| Strategy for Future Research Activity |
令和5年度では，昨年度に引き続き3つの研究計画を逐次進める．研究計画①集団浸潤をもたらすシグナル経路の探索については，分泌タンパク質CCL5と集団浸潤との関係を明らかにすることに注力する．具体的には，INFBとSTAT1の発現を制御するシグナル経路を調べる．加えて，CCL5はJAK/STAT経路以外にもNF-kB経路，PI3K経路に関わることが報告されているので，これらの経路が集合浸潤に関わる可能性についても調べる．さらに，CCL5の受容体であるC-C motif chemokine receptor 5（CCR5）が腫瘍形成を促進することが報告されているので，CCR5の発現抑制あるいは阻害剤投与実験を行うとともに，CCL5の組換え発現を行い，低浸潤のサブクローン株に投与することで，浸潤能が上昇するかどうかを調べる．
研究計画②細胞間に特異的に見られる仮足構造の解析については，マイクロアレイの結果を検討し，走査型電子顕微鏡で観察された糸状，こん棒状，ヒダ状など形態の異なる様々な仮足構造の形成に関わるタンパク質の同定を目指す．さらに，それらのタンパク質と集団浸潤との関わりについて調べる．
研究計画③集団浸潤の普遍性の確認については，実験で用いたコラーゲンゲルが100 Pa程度であるため，集団浸潤の観察には適さない可能性があるので，コラーゲンの濃度および架橋度を変えることでゲルの弾性率を10 KPa程度にまで上昇させて実験を行う．具体的には，ゲニピンという低毒性の架橋剤をコラーゲンゲルに加えて各種がん細胞の3次元培養を行い，集団浸潤の有無を調べる（本実験方法は，研究代表者の研究室で確立させた独自の技術であり，細胞が生きたままゲルの弾性率を定量的に変化させることができる）．
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Report
(2 results)
Research Products
(8 results)
