Development of fluorescent labeling method for AHL receptors responding to cross-kingdom signaling

Research Project

Project/Area Number	21K14765
Research Category	Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	Basic Section 38020:Applied microbiology-related
Research Institution	Utsunomiya University
Principal Investigator	Nasuno Eri 宇都宮大学, 工学部, 助教 (80709329)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2023-03-31
Project Status	Completed (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000) Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000) Fiscal Year 2021: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000)
Keywords	クオラムセンシング / N-アシルホモセリンラクトン / LuxR familyタンパク質 / 蛍光プローブ / 細胞間情報伝達 / アシル化ホモセリンラクトン / 微生物間相互作用 / AHLレセプター
Outline of Research at the Start	N-アシルホモセリンラクトン(AHL)を情報伝達分子とした細胞間情報伝達機構（クオラムセンシング）は、同種の細菌間だけでなく真菌や植物と細菌間でのシグナリングにも関与している。しかしこの生物種を超えた複雑なAHLシグナリングの全容は未だ解明されていない。そこで本研究では、細菌細胞内でAHL受容体と特異的に結合して蛍光標識するAHL型プローブを合成し、AHL受容体を有する細菌群を簡便かつ網羅的に可視化する新しい蛍光標識法の開発を目指す。
Outline of Final Research Achievements	Some Gram-negative bacteria have a quorum sensing (QS) that controls the expression of genes, depending on the intracellular concentration of an acyl homoserine lactone (AHL) as a signal molecule. In this study, we developed a unique fluorescent probe to specifically label the LuxR which is known as an AHL receptor. 4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole (NBD) groups were introduced to the acyl chain end of AHLs with different chain length as a chromophore. CviR derived from Chromobacterium violaceum, which regulates to produce a purple pigment in response to AHL, was selected as a model LuxR. As a result of the fluorescence labeling test, all AHL-NBD probes with acyl chain lengths from C6 to C12 could be fluorescently labeled the LuxR, especially the long-chain AHL-NBD probe showed particularly high fluorescence intensity. Since the AHL-NBD probes were able to label the proteins both in vitro and in vivo, we will further evaluate the labeling activity of our probes for the unknown LuxR.
Academic Significance and Societal Importance of the Research Achievements	データベースに登録されている3000種以上の細菌ゲノムから同定されたAHL受容体の約80%は、ペアになるAHL合成酵素が存在しない。AHL受容体を特異的に蛍光標識可能なAHL-NBDプローブは、これらのAHL受容体のみを保有する細菌の細胞間情報伝達機構を簡便に特定する新規解析ツールと言える。このAHL-NBDプローブを用いることで細菌にとどまらず細菌と競争・共生関係を構築している動植物まで含む広範な生物種を対象とした細胞間情報伝達機構による遺伝子発現制御システムの解明に繋がると期待される。