| Project/Area Number |
21K15124
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 44030:Plant molecular biology and physiology-related
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
後藤 千恵子 神戸大学, 理学研究科, 学術研究員 (00792269)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
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| Keywords | 側根 / 側根創始 / オーキシン / fwr / fsp1 / SUR2 / CYP83B1 / TOLS2 / 側根形成 / シロイヌナズナ |
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| Outline of Research at the Start |
維管束植物における側根の発生は、根の内鞘細胞の一部（側根創始細胞）がオーキシンを受容し分裂することから始まる。シロイヌナズナにおいてオーキシン受容を示すDR5:LUCIFERASEレポーター遺伝子による発光部位は主根上に点在し、その部位から側根が出現する。先行研究により、特定のオーキシンの生合成酵素遺伝子が側根創始細胞や根冠細胞で発現することが示唆されてきた。しかし、観察技術上の制約により、それらの酵素によって合成されたオーキシンが側根創始細胞に受容されるかの検証が不十分であった。本研究では新たに高分解能観察の系を確立し、側根創始細胞が受容するオーキシンの生合成と蓄積を制御する機構を解明する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
側根の発生は、根の内鞘細胞のうち一部が「側根創始細胞」としてオーキシンを受容し非対称分裂することで開始され、その後細胞分裂が繰り返されて側根原基が形成される。本研究では、オーキシンが生合成される部位とオーキシンが将来の側根創始細胞に隔離・蓄積される仕組みを明らかにすることで、側根創始の初期段階について理解を深めることを目的とした。
オーキシンが側根創始細胞に隔離・蓄積されにくくなった変異体にfewer roots（fwr）がある。このfwr の表現型を抑圧する変異体のスクリーニングによりfewer roots suppressor 1 (fsp1）fwrが単離されており、fsp1の原因遺伝子はSUR2/CYP83B1である。SUR2/CYP83B1はインドールグルコシノレート生合成に関わる酵素であるが、その生合成経路は一部がオーキシン生合成経路と重なっており、SUR2/CYP83B1が欠損すると内生オーキシン量が増加する。
オーキシン応答レポーターDR5:LUCを導入すると、主根上に発光が点状に観察される。この点状部位をDR5:LUCサイトと呼ぶ。DR5:LUCサイトは、根端付近で生じたあとそのまま安定して維持される場合（後にそこから側根が生じる）と、消失する場合（側根は形成されない）がある。fsp1では、DR5:LUCサイトが生じる頻度は野生型と有意差がなかったが、DR5:LUCサイトの消失頻度は野生型より低かった。側根創始細胞で産生されるTOLS2ペプチドは、DR5:LUCサイトの消失を促進する働きがあるが、fsp1においてはTOLS2ペプチドに対する感受性が野生型よりも低かった。これらことから、fsp1においては本来よりも余分にオーキシンが生合成され、そのオーキシンが内鞘細胞（の一部）で始まる側根発生に寄与している可能性が考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、申請時点で「１．側根創始に必要なオーキシンの生合成が行われる細胞の特定」および「２．側根創始細胞にオーキシンが蓄積される仕組みの解明」を計画した。また、初年度に得られた結果から、側根創始に影響を与えるSUR2の解析を新たに計画に加えた。これまでの進捗は以下の通りである。
fsp1 はsur2のアリルであり、野生型よりも側根数が多い。SUR2/CYP83B1はインドールグルコシノレート生合成に関わる酵素をコードしており、プロモーター解析からSUR2/CYP83B1 は内鞘細胞で発現していることが分かった。fsp1 とsur2ではオーキシン含量が野生型よりも多くなった。インドールグルコシノレート生合成経路とオーキシン生合成経路がつながっていることを合わせて考えると、野生型植物体の内鞘細胞ではインドールグルコシノレートが生合成されているのに対し、fsp1 /sur2 の同じ部位では余分にインドールグルコシノレートの代わりにオーキシンが余分に生合成されていると予想される。興味深いことに、fsp1 では野生型に比べてオーキシン応答を示すDR5:LUCサイト（輝度の高い点で、輝度が安定した場合は将来側根出現部位となる）の消失頻度が低かった。また、fsp1 は野生型に比べてTOLS２ペプチドによるDR5:LUCサイト消失の程度が低かった。これらのことから、fsp1変異（SUR2の機能低下）はオーキシン生合成量の増加を介して側根創始部位の安定的な形成に寄与することが示唆された。
以上の結果を得、本年度は論文の出版に至ったため、側根創始におけるオーキシン分布の制御機構について解明を目指す本研究はおおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
初年度の報告書の「研究実績の概要」に記載の理由により、「根冠剥離時に側部根冠細胞からオーキシンが供給されるという仮説の検証」を除き、当初の計画を推し進める（以下１、２）。さらに、本報告書の「現在までの進捗状況」に記載のSUR2についてさらなる解析を進める（以下３）。
１．側根創始に必要なオーキシンの生合成が行われる細胞の特定：既知のオーキシン生合成遺伝子の発現を詳細に調べ、側根創始細胞での発現が見られたものに関しては変異体解析により側根創始・側根発生への関与を検証する。
２．側根創始細胞にオーキシンが蓄積される仕組みの解明：オーキシン排出輸送体PINsの細胞膜への偏在について、特に内鞘細胞に注目しながら観察し、特定のPINが側根創始に関与する可能性を探る。
３．側根創始に影響を与えるSUR2の解析： SUR2の機能が異常な変異体fsp1/sur2において、オーキシン応答蓄積の過程を時間および空間分解能を上げて詳細に解析する。また、fsp1/sur2におけるPINsの局在を観察し、SUR2のオーキシン蓄積への関与を検証する。加えて、fsp1/sur2 に対するTOLS2ペプチドの作用機序についての解析を行う。
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