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アンジェルマン症候群 のUBE3Aアンチセンス転写抑制による新規遺伝子治療の開発

Research Project

Project/Area Number 21K15913
Research Category

Grant-in-Aid for Early-Career Scientists

Allocation TypeMulti-year Fund
Review Section Basic Section 52050:Embryonic medicine and pediatrics-related
Research InstitutionNational Center for Child Health and Development

Principal Investigator

三浦 茜  国立研究開発法人国立成育医療研究センター, 成育遺伝研究部, (非)研究員 (40795449)

Project Period (FY) 2021-04-01 – 2027-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2025: ¥130,000 (Direct Cost: ¥100,000、Indirect Cost: ¥30,000)
Fiscal Year 2024: ¥650,000 (Direct Cost: ¥500,000、Indirect Cost: ¥150,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Keywords遺伝子治療 / アンジェルマン症候群 / UBE3A-ATS転写抑制 / CRISPR/dCas9 / AAV5 / 神経疾患 / 先天性疾患 / AAV
Outline of Research at the Start

アンジェルマン症候群(Angelman syndrome: AS)は、重度の精神遅滞、てんかん、失調性運動障害を引き起こす遺伝性の神経発達障害疾患であり、未だ根本治療はない。神経細胞において母片由来のUbe3a遺伝子の欠失や変異によりUbe3a遺伝子が働かなくなると、ASを引き起こすと考えられている。一方、父方由来Ube3a遺伝子は無傷で沈黙している状態のため、正常なUbe3a発現の源となる可能性がある。そこで本研究では、不活性型Cas9と転写抑制因子(KRAB)を用いた特定の遺伝子の発現を調節する技術により、神経細胞で高効率に父方由来Ube3a遺伝子を働かせる新規遺伝子治療の開発を試みる。

Outline of Annual Research Achievements

アンジェルマン症候群はUbe3a遺伝子の欠失や変異による機能障害から引き起こされる。本研究では、dCas9-KREB-MeCPsによるUBE3A-ATS領域の転写調節技術によって、SNRPN領域のプロモーターで始まる伸長反応を抑制することで、Ube3a遺伝子発現回復を試みる。
本年は、2022年6月1日から2023年4月10日まで、産前産後休暇と育児休業を取得していたため、休業期間は研究を中断していた。育児休業が終わり、研究が再開してから、細胞培養と遺伝子導入の実験準備を進めている。
今後は、SH-SY5Y株にdCas9-KRAB-MeCP2ベクターとgRNA発現ベクターをエレクトロポレーション法により遺伝子導入を行い、UBE3A-ATS発現低下レベルにより、遺伝子治療に最適なgRNAを選択する。さらに、dCas9-KRAB-MeCP2ベクターと最適なgRNAベクターの配列を搭載した、AAV5ウイルスベクターの作製を行う予定である。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

産前産後休暇と育児休業を取得したため、本年度の目標であった、最適なgRNA選択のために、神経芽細胞腫へのCas9ベクターと複数のgRNAベクターの遺伝子導入による、UBE3A-ATS発現低下の解析ができていない。遺伝子治療に最適なgRNAを選択した後、AAV5ウイルスベクターの作製を行う予定である。

Strategy for Future Research Activity

神経芽細胞腫を用いて、UBE3A-ATS転写抑制に最適なgRNA配列を確認した後、Cas9配列と選択したgRNA配列を含むウイルスベクターを作製する。作製したウイルスベクターをHEK293T細胞へ遺伝子導入を行い、ウイルス産生細胞を作製する。ウイルス産生細胞から、AAV Extraction solutionを使用して、ウイルス粒子の精製を行う。作製したウイルス粒子は神経芽細胞腫に感染させ、UBE3A-ATS発現低下の確認を行う。

Report

(2 results)
  • 2022 Research-status Report
  • 2021 Research-status Report

URL: 

Published: 2021-04-28   Modified: 2023-12-25  

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