| Project/Area Number |
21K19014
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 35:Polymers, organic materials, and related fields
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| Research Institution | National Institutes for Quantum Science and Technology |
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Principal Investigator |
長田 健介 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 量子医科学研究所 分子イメージング診断治療研究部, グループリーダー (10396947)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥6,240,000 (Direct Cost: ¥4,800,000、Indirect Cost: ¥1,440,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
Fiscal Year 2021: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
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| Keywords | DNA複合体 / 高次構造変換 / ポリイオンコンプレックス / ヌクレオソーム / 転写調節 / 非ウイルス性ベクター / ＤＮＡ複合体 / 高分子 |
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| Outline of Research at the Start |
生物は、高分子の一次構造をもとに高次構造を組み上げ、その構造変換を通じて会合-解離の平衡を動かし、機能を創発、ついには生命の営みにつなげている。本研究では、生命活動の源とも言える遺伝子発現プロセスに着目し、その作動原理を高分子科学で再現することによって転写調節機構を物質科学的に理解することを目標とする。具体的には、DNAと高分子とから多様な高次構造のDNA/高分子複合体を構築、その高次構造を変換させることで転写調節を引き出すことに挑戦する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
生物は、高分子の一次構造をもとに高次構造を組み上げ、その構造転移を通じて会合-解離の平衡を動かし、機能を創発、ついには生命の営みにつなげている。一方、現在の物質科学は、高分子集合体の高次構造を意図して組み上げることまでできているものの、それを構造変換することに踏み込めていない。本研究では、正電荷性連鎖と中性連鎖からなる高分子を使って一本のDNAに多様な高次構造を作らせ、その高次構造を電荷密度の調節によって変換、その効果を転写活性の制御として結実させる事に挑戦する。具体的には、ゲノムに見られる超らせん構造を有するDNAとしてプラスミドDNA（pDNA）を選択し、合成高分子との相互作用により折りたたみ、高次構造を作らせる。これをヌクレオソームのモデル系として取り扱い、その高次構造の変換を試みる。合成高分子として、ヒストン－DNA間の相互作用に重要な役割を果たしているリジン残基を重合したポリ-L-リシン（PLL）に、PLL/pDNA複合体を二次会合させずに水和させるための親水性高分子ポリエチレングリコール（PEG）を結合させたブロック共重合体PEG-PLLを用いる。
初年度は、PEG-PLLブロック共重合体を合成する環境整備ならびにPLLおよびPEG連鎖の分子量の異なる種々ブロック共重合体の用意を完了した。2022年度は、PEG-PLL/pDNA複合体を調製、その高次構造を原子間力顕微鏡を用いて観察する手段を構築した。また、PLL鎖の電荷密度をその場で減少させる条件検討を進めた。2023年度は、PLL鎖のアミノ基を部分的にアセチル化することで電荷密度を調節、PEG-PLL/pDNA複合体の高次構造を変換させることに成功した。また、これによる転写活性の評価を進めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度は、高分子合成の環境を整えるとともに、PLLおよびPEG連鎖の分子量が異なる一連のブロック共重合体を用意することができた。PEG-PLL/pDNA複合体の高次構造は、原子間力顕微鏡（AFM）を用いて観察した。当初計画では外部機関にある透過型電子顕微鏡（TEM）を用いる予定であったが、空間分解能という点でTEMに及ばないものの当研究室保有のAFMで十分に高次構造を判別することが可能であることを確認した。2022年度には、種々PLLおよびPEG連鎖の分子量の異なるブロック共重合体を用いて複合体の高次構造を観察し、PLL電荷数と複合体高次構造との関係を理解した。2023年度は、PEG-PLL水溶液に対し、無水酢酸によるPLLアミノ基のアセチル化を試み、pHを中性付近に保ったままPLL電荷を減らしていく条件検討を行い、実現可能な条件を確認し、第一目標を達成した。これを受け、PEG-PLL/pDNA複合体に対しPLLのアセチル化を試みた。電気泳動法およびpDNAの凝縮度の評価から、アセチル化度を調節することで複合体の高次構造が変えられる事を確認した。現在、転写活性評価法の検討を進めている。現時点で高次構造と転写活性との相関を明らかにするまでに至っていないが、本研究の第2目標である複合体の高次構造変換に成功していることから、概ね順調に進んでいると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
PEG-PLL/pDNA複合体の高次構造変換に成功したことを受け、具体的な高次構造を液中AFMを用いて評価することを行う。一方、高次構造変換前後での転写活性評価は、DNAから転写されたmRNAをキャピラリ電気泳動で検出する方法を進めている。系中には、複合体、複合体に関与していないPEG-PLL、転写されたmRNAならびにpDNAなど様々な物質が含まれている。電気泳動法で生成したmRNAを正確に定量できないときは、蛍光オキシヌクレオチドを用いる方法ならびにポリメラーゼ連鎖反応法を用いる方法に切り替える。
現在進めている試みは、DNA複合体の凝縮度を緩ませることで、転写活性をoffからonにすることである。これが成功した暁には、その逆反応、DNA複合体の凝縮度を高めることで転写活性をonからoffに調節することに挑戦する。これにより、生命活動の源とも言える遺伝子発現調節の作動原理を高分子科学的に再現するという本研究の最終目標の達成を目指す。
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