Development of a screening procedure for muscle hypertrophy/atrophy related molecules by using myotube cells and comprehensive gene knockdown
| Project/Area Number |
21K19737
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 59:Sports sciences, physical education, health sciences, and related fields
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| Research Institution | Nippon Sport Science University |
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Principal Investigator |
中里 浩一 日本体育大学, 保健医療学部, 教授 (00307993)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2024-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥6,240,000 (Direct Cost: ¥4,800,000、Indirect Cost: ¥1,440,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
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| Keywords | Nsmaf / TNFα / 骨格筋 / 分化 / 筋萎縮 / 炎症 / 骨格筋分化 / Myomixer / 探索的ＲＮＡ干渉 / 骨格筋細胞 |
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| Outline of Research at the Start |
加齢や疾患による血中炎症性サイトカインの増加は筋萎縮の誘因となる。セラミドは炎症性サイトカインによる筋萎縮の候補分子である。我々は培養筋管細胞のRNA干渉により探索的にセラミド代謝タンパク質群をノックダウン(KD)し、筋管形態を指標にスクリーニングを行った。その結果Nsmafが筋萎縮を誘発した。本申請の第一の目的はNsmafが速筋の形態制御に関わることを示すことである。また培養筋管細胞による探索的ＫＤを用いた筋形態制御因子の抽出は一次スクリーニングとしての有用性が高いと考えた。そこで本研究の第二の目的は探索的RNA干渉と機械学習を組み合わせたの自動化・多検体スクリーニング法の確立である。
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| Outline of Annual Research Achievements |
neutral sphingomyelinase activation associated factor (Nsmaf)は中性スフィンゴミエリナーゼを活性化することでセラミド合成を調節する因子と報告されている。またNsmafはTNFαのシグナル伝達経路を調節する因子としても知られている。本研究においてNsmafをサイレンシングすることによりげっ歯類由来C2C12筋細胞の筋分化と筋タンパク質合成調節に関与するかを検討した。
低分子干渉RNA（siRNA）を用いてNsmaf遺伝子発現を抑制（ノックダウン；KD）した（NsmafKD群）。スクランブル配列を有し非特異的配列を有するsiRNA処理をコントロールとした(Scr群)。その結果、筋芽細胞にて分化マーカーであるmyogeninやミオシン重鎖などはNsmafKDにより有意に発現上昇され、NsmafKDが筋分化を促進していることが示された。筋管細胞にてNsmafKDによって筋管の直径が細くなる様子が観察された。筋管形態に強い影響を与えるタンパク質合成は増加していたものの、筋細胞同士の融合に関わるとされるMyomixerがNsmafKDによって有意に減少していることが観察された。以上の結果からNsmafは筋分化や筋細胞融合に影響を与える新規筋分化制御因子であることが示された。
NsmafがTNFαシグナルに関与する直接的な証拠を得るためにまず培地中のTNFα濃度を測定し、特に分化培地中に大量のTNFαが存在することが確認できた。さらにSV40プロモーターにてNsmafを過剰発現させることでｍRNA量にて10倍以上の発現誘導に成功したが筋分化にはほとんど影響しなかった。以上からNsmafはTNFαシグナルにおけるゲートキーパーとして分化を制御する可能性が示唆された。ただしNsmafタンパク発現をとらえられず大きな課題が残された。
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Report
(3 results)
Research Products
(8 results)
