直接分化転換法におけるヒト特異的リプログラミングバリア機構の解明

Research Project

Project/Area Number	21K20639
Research Category	Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	0701:Biology at molecular to cellular levels, and related fields
Research Institution	Kyushu University
Principal Investigator	松田花菜江九州大学, 医学研究院, 特任助教 (90906348)
Project Period (FY)	2021-08-30 – 2023-03-31
Project Status	Discontinued (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥3,120,000 (Direct Cost: ¥2,400,000、Indirect Cost: ¥720,000) Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000) Fiscal Year 2021: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Keywords	ダイレクトリプログラミング / バリア機構 / 神経細胞
Outline of Research at the Start	申請者はこれまでに、転写因子の強制発現により、ヒト体細胞である臍帯静脈内皮細胞から、ヒト肝細胞およびヒト神経細胞へのダイレクトリプログラミングに成功した。その際に、マウスと比較してヒト細胞はリプログラミング効率が低く、ヒト特異的なリプログラミングバリア機構が存在することを見出した。そこで本研究では、ヒトの19,000遺伝子を欠損させることが可能なCRISPR libraryを用いて、ヒト細胞特異的バリア因子を同定し、ヒト特異的なリプログラミングバリア機構の解明に挑む。
Outline of Annual Research Achievements	申請者はこれまでに、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)へ6種類の転写因子を導入することにより、ヒト神経細胞へとダイレクトリプログラミングできることを見出している。また、ヒト細胞を用いたリプログラミングでは、マウス体細胞から神経細胞を分化転換する際と比較して、より多くの転写因子が必要であることや、神経細胞へと分化転換するまでの時間が多くかかることから、ヒト細胞にはリプログラミングを阻むヒト細胞特異的なリプログラミングバリアが存在することが示唆される。そこで申請者は本研究遂行により、ヒト特異的なリプログラミングバリア因子を明らかにすることを目的として本研究を進めた。バリアとして機能する候補因子の選定方法として３つの手法を実施した。１つ目は公共データを用いて、ヒト特異的またはヒト細胞において高発現している遺伝子に着目し、バリア候補となりうる遺伝子のノックダウン実験を実施する方法、二つ目は神経細胞および他の細胞へのリプログラミングの際にリプログラミング効率を上昇させる効果のある阻害剤などのケミカルを用いてバリアを破綻させる因子を探索する方法、３つ目はCRISPR Knockout pooled libraryを用いて、網羅的にバリア候補因子を選定する方法を実施した。その結果、ノックダウンの実験において複数のバリア候補因子を得ることに成功した。また、10種類のケミカルを処理することによりリプログラミング効率が飛躍的に上昇することも見出した。