Generation of African Swine Fever virus-resistant pigs by applying the concept of gene editing technology

• Project/Area Number: 21KK0124
• Research Category: Fund for the Promotion of Joint International Research (Fostering Joint International Research (B))
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Medium-sized Section 42:Veterinary medical science, animal science, and related fields
• Research Institution: Jichi Medical University
• Principal Investigator: 谷原 史倫 自治医科大学, 医学部, 准教授 (90754680)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 下田 宙 山口大学, 共同獣医学部, 准教授 (40719887) ; 田中 良法 岡山理科大学, 獣医学部, 助教 (00747933) ; 音井 威重 徳島大学, バイオイノベーション研究所, 教授 (30311814)
• Project Period (FY): 2021-10-07 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥18,980,000 (Direct Cost: ¥14,600,000、Indirect Cost: ¥4,380,000); Fiscal Year 2025: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2024: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000); Fiscal Year 2023: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000); Fiscal Year 2022: ¥2,730,000 (Direct Cost: ¥2,100,000、Indirect Cost: ¥630,000); Fiscal Year 2021: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
• Keywords: アフリカ豚熱 / ゲノム編集 / CRISPR/Cas9 / ブタ

Outline of Research at the Start

アフリカ豚熱（African Swine Fever: ASF）は家畜豚への驚異的な伝搬力と致死率から世界の養豚業を破壊しうる伝染病であり、現在までワクチンを含む治療法はない。本研究は、細胞内に侵入したウイルスDNAを特異的に切断・失活させるCRISPR/Cas9システムを体内で発現させることで、ASFウイルス感染防御能を付与したブタを作出する。現在もASFが散発し多数の野生株を保存しているベトナムで２機関と共同研究を行い、ASFウイルス感染抵抗性の実証を行う。

Outline of Annual Research Achievements

アフリカ豚熱（African Swine Fever: ASF）は家畜豚への驚異的な伝搬力と致死率から世界の養豚業を破壊しうる伝染病であり、現在までワクチンを含む治療法はない。本研究では、ブタの体内に発現させた遺伝子切断酵素Cas9とCas9を標的ゲノム配列に誘導するガイドRNA(gRNA) により侵入してきたウイルスDNAを切断・失活させるという発想のもと、ASFウイルスを標的としたCas9/gRNA発現ブタを作出する。細胞内に発現させたゲノム編集システムにより感染時に侵入してきたASFウイルスDNAを切断し、ASFウイルスの増殖を阻害することで感染防御能を付与する。現在もASFが散発し多数の野生株を保存しているベトナムで２機関と共同研究を行い、ASFウイルス感染抵抗性ブタ系統の作出を試みる。
細胞レベルでの感染実験をベトナムで実施するため、日本国内で初代ブタマクロファージにSV40LT遺伝子とpTERT遺伝子を組み込んだ不死化ブタマクロファージの作製に着手した。40日齢前後の若豚から腎臓を採取し、細胞培養を経てマクロファージを分離した。免疫蛍光染色によりマクロファージであることを確認後、ウイルスベクターを用いてSV40LT遺伝子とpTERT遺伝子を導入、培養を開始した。共同研究実施先のVietnam National University of Agriculture所属の共同研究者とは継続的に打ち合わせを行い、情報共有をしている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

ブタマクロファージの単離とSV40LT遺伝子とpTERT遺伝子の導入による不死化のステップで検討に時間を要し、進捗はやや遅れている。トランスジェニックブタの作出条件の検討（胚での予備検討）、ベトナム研究機関側との調整は完了しており、並行して胚を用いた実験を開始することで後れを取り戻す予定であり、研究に支障はない。

Strategy for Future Research Activity

研究計画の変更は現時点では無く、トランスジェニックブタの作出にむけた実験を開始する。並行して不死化ブタマクロファージを樹立後は速やかにCRISPR/Cas9システム発現コンストラクトを組み込み、ベトナムで実際に流行しているアフリカ豚熱野外株を用いた感染実験へと展開、研究を推進していく予定である。