| Project/Area Number |
22H00273
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Medium-sized Section 27:Chemical engineering and related fields
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
本多 裕之 名古屋大学, 工学研究科, 教授 (70209328)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
秋山 裕和 名古屋大学, 工学研究科, 助教 (60914140)
清水 一憲 名古屋大学, 工学研究科, 准教授 (70402500)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2025)
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| Budget Amount *help |
¥42,510,000 (Direct Cost: ¥32,700,000、Indirect Cost: ¥9,810,000)
Fiscal Year 2025: ¥6,630,000 (Direct Cost: ¥5,100,000、Indirect Cost: ¥1,530,000)
Fiscal Year 2024: ¥9,360,000 (Direct Cost: ¥7,200,000、Indirect Cost: ¥2,160,000)
Fiscal Year 2023: ¥9,360,000 (Direct Cost: ¥7,200,000、Indirect Cost: ¥2,160,000)
Fiscal Year 2022: ¥17,160,000 (Direct Cost: ¥13,200,000、Indirect Cost: ¥3,960,000)
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| Keywords | ペプチド / 可食性タンパク質 / 残基置換 / 実験計画法 / モデリング / 実施計画法 |
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| Outline of Research at the Start |
中長鎖の生理活性ペプチドの残基置換で最優性ペプチドを探索するとともに、劣性に陥らない程度に活性を保持する非劣性ペプチドを、可食性タンパク質中から効率よく探索する手法の確立を目指す。まず、実験計画法に基づき、置換残基の2因子間交互作用を評価し、多残基置換体の活性を予測する機械学習モデルを構築する。最優性生理活性ペプチドを探索したのち、非劣性残基置換ペプチドを可食性ペプチドDBから複数探索する。非劣性残基置換ペプチドを合成し、多種類の非劣性ペプチドが同時に濃縮できる条件を検証する。この研究を通して、優性ペプチドと非劣性ペプチドを組み合わせた生理活性ペプチド群の製造方法の確立を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
中長鎖の生理活性ペプチドの残基置換で最優性ペプチドを探索するとともに、劣性に陥らない程度に活性を保持する非劣性ペプチドを、可食性タンパク質中から効率よく探索する手法の確立を目指した。このため、次の3つの独創的な方法で解決を図った。＜課題１、探索＞すでに得ている優性の生理活性ペプチドを取り上げ、配列活性相関をモデリングすることで非劣性残基置換ペプチドの探索を試みた。活性を示す特性をもつペプチドが非劣性ペプチドになり得ることを示した。＜課題２、分解予測＞食品タンパク質を実際に種々のプロテアーゼで加水分解した。加水分解物をLC-MS/MS分析し、産業用酵素の切断点を明らかにした。＜課題３、濃縮精製＞独自に開発した焼成多孔性シリカゲル（HTシリカ）を用いて性質類似の非劣性ペプチド群の効率的濃縮法の確立を試みた。pHを変えて吸着させることで特性の違うペプチドが分離濃縮できるため、非劣性ペプチドの配列特性に合致したペプチド混合物の分離挙動を調べ、活性向上の程度を検証した。課題１、および課題2を中心に、課題3に関しても研究をスタートさせた。コレステロール吸収抑制ペプチドに関しては、タウロコール酸を用いた胆汁酸ミセルの崩壊活性を調べることで活性ペプチドを探索できる。1391種類のペプチドの活性データを用い、配列活性相関を調べることで、等電点が高く、かつC末端アミノ酸残基の疎水度が高いとミセル崩壊活性が高いことがわかった。そこで、カゼインのペプシン加水分解物を用いて、コレステロール吸収抑制ペプチドの探索と濃縮を試みた。中性条件でHTシリカに吸着、酸性条件で脱離することで、非劣性生理活性ペプチドで濃縮でき、活性は355倍向上することを明らかにした。また濃縮したペプチドの配列を解析した結果、ARHPHPHLS,というペプチドで最も活性が高いことを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
生理活性ペプチドの実用化に向けて、劣性ではないペプチド（非劣性ペプチド）の混合物を簡便に製造できる方法論の確立を目的に、可食性タンパク質中から非劣性ペプチドを効率よく探索する手法の確立を目指した。課題１（探索）に関して、コレステロール吸収抑制ペプチド、膵リパーゼ阻害ペプチドやアンジオテンシン変換酵素（ACE）阻害ペプチドに関して優性ペプチドの探索を進めた。胆汁酸ミセルを崩壊させることでコレステロール吸収抑制効果を示すペプチドに関して、全1391種の6残基ペプチドライブラリーを使ったDCA結合ペプチドのスクリーニング結果を用いて、重回帰分析で配列活性相関を解析した。等電点、極性、疎水度、分子量の4つのアミノ酸指標を説明変数とする全23指標で解析した結果、等電点が高く、かつC末端アミノ酸残基の疎水度が高いとミセル崩壊活性が高い傾向にあることがわかった。この特性を持つペプチドは、我々が開発した焼成多孔性シリカゲル（HTシリカ）で、中性条件で吸着し酸性条件で脱離するペプチドの特長に一致する。そこで、カゼインのペプシン加水分解物を用意し、HTシリカでの濃縮を試みた結果、活性が355倍高まることが明らかになった。また濃縮したペプチドの配列をLC-MS/MSで解析した結果、ARHPHPHLS,というペプチドの特定に成功した。課題2（分解予測）に関しては、大麦タンパク質ホルデインを種々のプロテアーゼで加水分解し、LC-MS/MSで分析して切断点を解析した。ホルデインはプロリン含量が高いため、プロリン部位を切断しやすい酵素オリエンターゼも試みた。その結果、他の酵素と比較して加水分解しやすいことがわかった。その加水分解物を用いて、アンジオテンシン変換酵素（ACE）阻害活性に関しても検討を開始した。膵リパーゼ阻害に関しては胆汁酸塩を添加した反応場にした際に活性が高くなることを明らかにし、リパーゼ阻害ペプチドの評価系を構築した。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き主に課題１を進めるとともに、課題3に関して検討する。課題１（探索）に関しては、コレステロール吸収抑制ペプチドだけでなく、膵リパーゼ阻害ペプチド、アンジオテンシン変換酵素（ACE）阻害ペプチド、抗炎症ペプチドに関しても優性ペプチドの探索を進め、同時に課題3に関する濃縮も試みる。ACE阻害ペプチドに関しては3残基以下の短残基ペプチドが多く報告されているので、LC-MS/MS解析においてはde novoシーケンス解析を用いる。リパーゼ阻害ペプチドに関しては、胆汁酸としてTCAを1mM含む評価系で活性が高く出ることを明らかにしたので、食品タンパク質由来の優性ペプチドの探索とともに、非劣性の膵リパーゼ阻害ペプチドの探索も試みる。
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