| Project/Area Number |
22H00411
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Medium-sized Section 43:Biology at molecular to cellular levels, and related fields
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
野田 展生 北海道大学, 遺伝子病制御研究所, 教授 (40396297)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
戸田 浩史 筑波大学, 国際統合睡眠医科学研究機構, 助教 (80862010)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥42,380,000 (Direct Cost: ¥32,600,000、Indirect Cost: ¥9,780,000)
Fiscal Year 2024: ¥13,650,000 (Direct Cost: ¥10,500,000、Indirect Cost: ¥3,150,000)
Fiscal Year 2023: ¥13,650,000 (Direct Cost: ¥10,500,000、Indirect Cost: ¥3,150,000)
Fiscal Year 2022: ¥15,080,000 (Direct Cost: ¥11,600,000、Indirect Cost: ¥3,480,000)
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| Keywords | ねむり / 抗菌活性 / 液－液相分離 / ショウジョウバエ / 天然変性タンパク質 / 液－液相相分離 / NMR |
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| Outline of Research at the Start |
睡眠は神経系を持つすべての動物に保存された現象であり、生命機能維持に不可欠であるが、その分子制御機構および本質的な機能は謎に包まれている。ショウジョウバエで同定された新規の睡眠誘因タンパク質‘Nemuri’は、睡眠制御の鍵を握ると考えられるが、その分子機能は全く不明である。Nemuriは天然変性タンパク質であることから、睡眠制御への液－液相分離の関与が強く示唆された。そこで本研究では、生化学、構造生物学、分子遺伝学、行動遺伝学を駆使して、Nemuriが持つ睡眠誘因活性と、相分離能力との関連を明らかにすることで、相分離という新規概念による睡眠制御機構の解明を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
睡眠は神経系を持つすべての動物に保存された必須の生命現象であり、生命体の機能維持に不可欠であるが、その分子制御機構および本質的な機能は謎に包まれている。ショウジョウバエの行動遺伝学したのちスクリーニングから、新規の睡眠誘因活性を持つタンパク質‘Nemuri’が報告され、睡眠制御の鍵を握ると考えられるが、その分子機能は全く不明である。そこで本研究では、生化学、構造生物学、行動遺伝学等を用いてNemuriの性状と相分離能力の分子基盤を明らかにするとともに、それが睡眠誘因活性の発現にどう関係するのかを明らかにする。
昨年度、Nemuriが天然変性タンパク質であることをNMRで確認したが、今年度はNemuriがショウジョウバエS2細胞でどのように挙動するのかを解析した。NemuriはN末端に分泌シグナルを持ち、細胞外へと分泌されるが、その際分泌シグナルの切断に加え、C末端側で切断を受け、アルギニンリッチなペプチドとなることがわかった。GUVを用いた解析の結果、Nemuri全長では膜結合や膜透過がほとんど観察されなかったのに対し、Nemuri断片は膜に強く結合し、さらに膜透過することがわかった。Nemuriはハエが感染症を罹った際に誘導され、睡眠誘引とともに抗菌活性を示すことが知られている。Nemuriの抗菌活性を調べた結果、全長や分泌シグナル切断体はほとんど活性を示さなかったのに対し、Nemuri断片は既知の抗菌薬と同程度の活性を示した。蛍光標識したNemuri断片を大腸菌に振りかけ、ライブイメージングを行った結果、大腸菌の細胞膜に結合後、速やかに細胞質へと移行し、リボソームやRNAが集ることが知られる細胞質両端に球状に集積した。さらにFRAP解析を行った結果、Nemuri断片は極めて高い流動性を示したことから、大腸菌内で相分離液滴を形成していることが強く示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
天然変性タンパク質であるNemuriが、S2細胞において分泌される際にC末端側で切断されること、その結果形成されたNemuri断片は高い細胞膜透過性と抗菌活性を持つことが明らかとなった。Nemuri断片は大腸菌内でリボソーム集積部位に液滴状構造を形成したことから、翻訳阻害により抗菌活性を示す可能性が示唆された。一方Nemuri断片が形成されなくなる変異を導入したNemuriをハエの脳神経系に発現させても睡眠誘引活性が保持されたことから、Nemuri断片の産生は睡眠誘引には必須でないこともわかった。Nemuriは睡眠誘引と抗菌活性という全く異なる2つの活性を持つことが最大の特徴であるが、断片化によりその2つの活性を分担している可能性が初めて明らかとなった。またリボソームとの相互作用が示唆されたことから、抗菌活性に加え睡眠誘引でもリボソームとの相互作用が関係している可能性が浮上し、睡眠誘引活性解明のための足掛かりができたと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
大腸菌内で形成されるNemuri断片液滴について、その物理化学的挙動を詳細に解析するとともに、リボソームとの相互作用様式を解析する。In vitroでNemuri断片液滴を形成させ、リボソームとの相互作用を調べるとともに、それが翻訳活性に与える影響を明らかにする。ショウジョウバエS2細胞内でのNemuriの挙動を詳細に解析し、ハエのリボソームに対するNemuriの相互作用および翻訳活性に与える影響、さらにはそれが睡眠誘引に与える影響を解析する。
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