膜結合型酵素の可溶性酵素化とプラズマローゲンライブラリー構築への応用
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22K04838
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 27040:Biofunction and bioprocess engineering-related
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| Research Institution | Chubu University |
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Principal Investigator |
岩崎 雄吾 中部大学, 応用生物学部, 教授 (50273214)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
ダムナニョヴィッチ ヤスミナ 名古屋大学, 生命農学研究科, 准教授 (00754673)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2023: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
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| Keywords | リン脂質 / 融合タンパク / プラズマローゲン / 脂質 / 酵素 |
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| Outline of Research at the Start |
プラズマローゲン(Pls)はリン脂質の一種で、痴呆症などとの関連から注目されている。
Plsの詳細な生理機能解明には分子構造が明確な高純度Pls標品が必要であるが、現行の調製法は非常に煩雑である。
そこで、Pls合成酵素であるプラズマニルエタノールアミン不飽和化酵素(PEDS)を用いた酵素合成を検討する。
本酵素は4回膜貫通型の膜酵素であるため、通常の組換え大腸菌での直接発現は困難である。
そこでタンパク質工学的に改変しPEDSを可溶性酵素化し、得られた可溶性PEDSを利用してPlsの酵素合成を試みる。
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| Outline of Annual Research Achievements |
1. 蛍光リン脂質を用いたPEDS活性検出法の開発
2022年度は膜結合型PEDSを可溶性タンパクとして発現することに成功したが、その酵素活性を検出することはできなかった。そこで、2023年度はPEDSの活性を検出するため、1位アルキル鎖末端を蛍光標識したアルキルアシル型リン脂質(NBD-PlsEtn)を合成し、これを基質としたPEDSの活性検出法を次の通り開発した。1)NBD-PlsEtnに酵素を作用させ、反応後の脂質を抽出して二次元TLCプレートにスポットする。2)一次元目はクロロホルム/メタノールで展開後、3) TLCプレートを塩酸蒸気に暴露する。NBD-プラズマローゲンのビニルエーテル結合は酸で開裂し、NBD-アルデヒドが生じる。4)続いて二次元目としてヘキサン/酢酸エチルを用いて一次元目とは直角方向に展開する。5)青色LED照射下でNBD蛍光を観察する。酵素反応時にプラズマローゲンが生成していれば、NBD-アルデヒドが検出される。
2. PEDS活性の検出
上記の方法を用いてPEDSの活性検出を試みたところ、1) 増殖中の膜結合型PEDS発現大腸菌へのフィーディング、2)増殖中の可溶性タンパク型PEDS発現大腸菌へのフィーディング、3)可溶性タンパク型PEDSを発現させた大腸菌菌体（休止菌体）, および4)可溶性タンパク型PEDS発現株の細胞破砕物（細胞内可溶性画分）に酵素活性が検出された。つまり、可溶性タンパク化したPEDSは酵素活性を保持していることを初めて示すことができた。次に可溶性タンパク型PEDSをNi-NTAで精製し、活性検出を試みたが、活性を検出することはできなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
蛍光リン脂質を用いて可溶性タンパク化したPEDSの酵素活性を示せたことは非常に意義がある。しかし、反応効率など改善すべき点が残されており、全体としてはやや遅れていると言わざるをえない。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初計画では微生物由来PEDSとヒト由来PEDSを同時並行で検討してきた。この理由は、微生物PEDSはヒトPEDSよりも発現が容易である反面、その基質特異性は疎水鎖に分岐構造を持つiso型脂質しか受け付けない可能性が懸念されたためである。しかし、今年度の検討で 微生物PEDSは末端にNBD標識した基質でも受け入れることが判明し、微生物PEDSの疏水鎖に対する特異性は高くないと予想され、当初の懸念が払拭された。
最終年度は微生物PEDSに絞って検討していく。Ni-NTA精製したPEDSでは活性を検出できなかったことから、酵素中の鉄がNi-NTAで除去されてしまった可能性がある。そこで精製法を見直し、通常のイオン交換カラムなどでの精製を検討する。全体として活性が低いのは酵素中のFe(II)がFe(III)に酸化され、Fe(II)に再生されていないためと考えられる。このため、Cb5などの補因子の添加を検討する。
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Report
(2 results)
Research Products
(1 results)
