| Project/Area Number |
22K05328
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 37020:Chemistry and chemical methodology of biomolecules-related
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
此木 敬一 東北大学, 農学研究科, 准教授 (40292825)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | マイトトキシン / 蛍光標識 / 生細胞観察 / Membrane Blebbing / 天然物化学 / 作用機序 / ケミカルプローブ / ライブセルイメージング |
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| Outline of Research at the Start |
単離後、約40年経た現在においてもマイトトキシン(MTX)が示す急性致死毒性 (フグ毒テトロドトキシンの約200倍)の作用機序は不明である。研究代表者は HAP1細胞に含まれる約18,000の各遺伝子がMTXの細胞毒性に及ぼす影響を調べ(CRISPR)、MTXが脂質を分子標的とすることを推測し、その後、研究協力者はMTXがことを明らかにした。本研究では、人工細胞や単一遺伝子を欠損させた培養細胞に対するライブイメージングを行い、CRISPR スクリーニングの結果をより一層、検証するとともに、MTXによる「膜透過性亢進作用」の完全解明を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
1. 昨年度に続き、蛍光標識ジエノフィルを合成し、マイトトキシンの分子末端に存在する共役ジエンに付加反応させる計画を実施した。(1) 昨年度、断念した3-ホルミルペリレンを原料とする スキーム２を再度、試みた。カニッツァーロ反応により得られたカルボン酸を伸長反応に付し、97%の収率でアジド体としたPTAD-Alkyneとのクリック反応により17%の収率でジエノフィル前駆体を得た。しかし、このジエノフィル前駆体は不安定であり、酸化反応に続くMTXとのDiels-Alder反応に供与することはできなかった。(２) ジエノフィルが分子内に存在する蛍光基と反応する傾向が見て取れたため、最初にジアセトキシヨードベンゼン（酸化剤）存在下、マイトトキシンとPTAD-Azide（ジエノフィル前駆体）をDiels-Alder反応させ、その上で蛍光色素を有するシクロオクチンと歪み解消型クリック反応させ、蛍光標識マイトトキシンを得ることにした。本反応はモデルとして選択したビタミンD3では首尾良く進行したため、同様にMTXでも試行した。その結果、Diels-Alder付加体および蛍光標識体を順次、質量分析にて確認したが、質量数にわずかなずれが理論値との間に生じており、結果を考察中である。
2. マイトトキシンの細胞毒性を増強する単一遺伝子欠損株、減弱する単一遺伝子欠損株をそれぞれ一株ずつ、RNAseq解析した。いずれもoff-target効果により当該遺伝子以外にも発現量が顕著に低下する遺伝子が見つかり、前者に至っては当該遺伝子の発現量の低下が著しくないこともわかった。欠損の効果をより明確に確認したく、長期間、具体的には、24時間、4日間、8日間、14日間、マイトトキシンと暴露したが、期待したような顕著な差は見られなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現在、共同研究者により蛍光標識MTXを人工細胞に投与する実験がなされており、好結果が得られることを期待している。
単一遺伝子欠損株を用いた実験についても計画通りに進行している。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. 蛍光標識MTXはMTXに比べて細胞毒性が著しく低下しているため、人工細胞に対する蛍光観察も期待通りに進行しない可能性もある。その場合、別途、MTXの水溶性部位をハプテンとする抗体調製を目指すべく、化学合成に着手する。
2. 単一遺伝子欠損株を用いた実験の結果より、特定の脂質分子が細胞膜外葉と内葉を行き来することをマイトトキシンが妨害することを想定している。この特定の脂質の動きをモニターする蛍光色素や蛍光標識脂質を用いた観察実験を行う予定である。
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