| Project/Area Number |
22K05383
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 38020:Applied microbiology-related
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
阿野 嘉孝 愛媛大学, 農学研究科, 准教授 (00403642)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
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| Keywords | PQQ酵素 / 酢酸菌 / 酵素 / グリセロール脱水素酵素 |
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| Outline of Research at the Start |
酢酸菌は食酢製造に関わる伝統的な発酵微生物であるが、その能力は酢酸発酵にとどまらず多彩な化合物を生産することができる。この多彩な発酵能力はピロロキノリンキノン（PQQ)を補欠分子族としてもつPQQ酵素の「ゆるい」基質認識機構の恩恵である。
本研究では、このPQQ酵素に特徴的な「ゆるい」基質特異性を、指向性進化法を用いた酵素の改変により優良変異体酵素を獲得して解析することによって、構造学的な理解と産業利用を目指すものである。
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| Outline of Annual Research Achievements |
酢酸菌においてPQQ酵素は，産業的な物質生産の中心的役割を担う重要な酵素群であり，「ゆるい」基質特異性を示すことが特徴的である。このゆるい基質特異性に起因して，新しく発見される酵素反応は，持続可能社会のための新たな微生物変換技術の創出にもつながることから注目されている。
本研究では，このゆるい基質特異性の構造学的理解を深めるために，その障害となっている酵素の安定性の向上，さらには物質生産性の向上を目指して，進化指向的変異導入法を確立して優良変異体を獲得することを目的とし，得られた変異体酵素を用いて基礎研究および応用研究を深めることにある。
２年目となる今年度は，初年度に獲得した酢酸菌PQQ依存性グリセロール脱水素酵素（GLDH）の優良変異体に着目し，その酵素活性の評価に注力した。初年度に申請者が確立した「酢酸菌直接形質転換選抜法」によって得られた変異体の多くは負の影響をもたらすものであったが，PQQの結合を阻害する化合物存在下でも安定な活性を示すことができる変異体であることが明らかとなった。この優良変異体について物質生産性を確認したところ，物質生産性およびその反応に伴う呼吸活性とも安定に向上することが明らかとなった。
３年目以降は，これらの変異体酵素について精製酵素を準備して，より詳細な酵素活性の評価を行うとともに，本酵素の「ゆるい基質特異性」という特徴的な機能と立体構造の関係を明らかにするための糸口を掴んでいく予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでに酢酸菌直接変異導入選抜法の最適化，および進化指向的変異に向けてゲノムシャッフリングによる多重変異株の条件を確立した。あわせて２株の機能向上に関与する変異体の獲得に成功した。また，これらの変異株の詳細な解析により，この変異箇所がPQQ結合に関与し結合性を強化，安定化していること，またその変異により，本酵素が寄与する物質生産能ならびに関連する呼吸活性が向上していることを明らかにした。一方，その変異体について基質特異性が変化していることも見出した。今後は，変異と基質認識の関係について調査を進めていく。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究の目指すところは，GLDHの構造解析，ゆるい基質特異性を特徴づける構造を明らかにすることである。本研究課題では，その障害となる補酵素の結合安定性をクリアすることをゴールに設定している。今回，強力な安定酵素が取得できたことから，酵素学的評価とともに，共同研究による構造解析へと進めていく予定である。そのために，精製酵素の調製および解析へと進展させていく。
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